Liebe Könner der Paraffin-Technik, ich brauche Hilfe
Seit vergangenem Wochenende habe ich meine ersten Blöckchen gegossen, das ist ja schon einmal ein kleiner Erfolg. Die ersten Tests habe ich mit Tannennadeln und Stamm vom Ahorn gemacht. Schnitte wurden am Leitz Grundschlittenmikrotom mit adaptiertem Jung Messerhalter (damit kann ich viel besser ziehende Schnitte machen) gemacht.
Mit dem Ahorn hat alles funktioniert, der hat sich nicht so stark gedreht und hat sich gut im ca. 40 Grad warmen Wasserbad gestreckt. Von 10 Schnitten sind bei Kontrolle bei 100 facher Vergrößerung 9 für das Farben in die nächste Runde gegangen ...
Bei der Tannennadel habe ich mich gleich an einen Längsschnitt gewagt und da streckt sich nix?!?
Ich schneide mit Leitz Einmalklingen, mit einer alten bis auf 3 Schichten über die Nadel geschnitten, Klingenwechsel und der Block zeigt eine glänzende, homogene Oberfläche (nach dem Schneiden mit der neuen Klinge, mit dem alten Messer gibt es Spuren in Streifenform). Nach Romeis, Gerlach und co sollte es bis daher stimmen ...
Ich habe trocken geschnitten, die Klinge wurde nur entfettet und nach dem sie trocken war habe ich losgelegt. Wenn ich uneingebettet schneide erfolgt dies ja feucht ==> stimmt mein Trockenschnitt?!?
Wenn sich bei einem uneingebetteten Schnitt ein Problem habe stelle ich einen feuchten Pinsel auf den Schnitt und der schwimmt dann eigentlich gerade auf den Messerhalter auf, wie gehe ich da bei eingebetteten Schnitten vor?!?
Im Gerlach und im Romeis steht, nach dem Schneiden geht es ins Streckbad ...
Könnt Ihr mir da bitte mit Rat zur Seite stehen, ich hatte auch noch nie Gelegenheit bei einem Schnitt dabei zu sein und nur die Bücher .... Ich gehe aber davon aus, dass ein Tipp mich auf de richtigen Weg bringt :-))
Liebe Grüße :-)
Gerhard
Gerard,
Was bei dich nicht gut geht kann ich schlecht beurteilen.
Was sich wohl machen lässt ist zeigen wie ich es mit ein Rotationsmikrotom mache und wie ich die Schnitte strecke, beides in YouTube.
Schneiden: http://www.youtube.com/watch?v=qGyE4p9XanA
Strecken: http://www.youtube.com/watch?v=cbQnZr0wx0I&feature=related
Grüße Ronald
Hallo Ronald
Danke, habe beide mit Faszination mehrmals angesehen, so hätte ich mir das bei mir auch vorgestellt :-))
Was ich aber schon einmal erkennen kann, Dein Wasserbad ist deutlich wärmer wie meines ==> ich habe 40 Grad, Du schreibst 45 bis 50 ...
Das werde ich am Nachmittag testen, jetzt habe ich leider noch einen Termin ...
Wenn das nicht hilft werde ich auch ein anderes Mikrotom verwenden (das Jung 820 Histout II) ist ja auch einsatzfähig :-)) Ich habe es nur noch nie verwendet, aber bereits generalüberholt und die defekten Teile auf der Drehbank nachgefertigt ...
Ich bin schon gespannt...
:-)
Gerhard
Lieber Gerhard,
wen Du ein Grundschlittenmikrotom hast, warum machst Du dann ziehende Schnitte? Der Paraffinblock, den Du hast, muss mit zwei exakt parallel geschnittenen Kanten ausgeführt werden. Dann stellst Du die Messerkante parallel zu einer dieser Blockkanten und schneidest. Dann kannst Du sogar mehrere Schnitte nintereinander machen, die ein Band ergeben. Wenn Du gut eingebettet hast, soltest Du auf diese Weise hinreichend dünne Schnitte hinbekommen.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Gerhard,
es ist zwar nicht die Reine Lehre - aber wir sind ja unter uns ;).
Es gibt immer wieder Schnitte, die absolut nicht wollen wie man selbst; obwohl ich mich nur in der Aufarbeitung von tierischem/menschlichem Gewebe auskenne, wird das bei pflanzlichem Material auch nicht viel anders sein. In solchen Fällen hat es sich bewährt, einen großen Wassertropfen auf den Objektträger aufzubringen, diesen im Wärmeschrank vorzuwärmen (ca. 8°C unter dem Schmelzpunkt des Paraffins) und dann den Schnitt vorsichtig mit dem Pinsel auf dem Objektträger auszurollen. Dann kommt der Schnitt zum Strecken in den Wärmeschrank. Das Wasser läss man am besten nicht einfach verdunsten, da sich der Schnitt dann auffaltet, sondern man kippt das Wasser zur Seite ab, wobei man darauf achtet, dass sich der Schnitt schön ausgestreckt entfaltet. Dann tupft man mit einem Löschblatt (gibt es extra für die Histologie) oder zur Not auch Küchenpapier die Wasserreste weg und lässt den Schnitt wie gewohnt trocknen. Bei einigermaßen Geschick kann man so "unstreckbare" Schnitt ausfziehen.
Viele Grüße,
Florian
Hallo Gerhard,
sobald man nicht selbst gesehen hat wie Du den gesamten Vorgang gestaltet hast, ist es wirklich nicht leicht zu helfen.
Ich vermute aber, das die Tannennadel durch das Intermedium einfach zu spröde geworden ist.
Falls Du den Block nicht verwerfen willst, könnte ich noch folgende Tipps beisteuern:
1. Feucht schneiden, d.h. Blockoberfläche und ggf. auch Messer mit 30% Ethanol befeuchten.
2. Das Gewebe im Block weicher einstellen. Dafür das Objekt anschneiden und mit Glycerin(?) überschichten und über Stunden (ggf. Tage) eindringen lassen.
Den ersten Tipp habe ich von einem Altmeister im Paraffinschneiden, den zweiten Tipp müßtest Du im Romeis oder Gerlach nachlesen können.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Gerhard,
Was Florian schreibt ist auch eine gute Möglichkeit nur wirkt das bei mir nie wirklich gut. Mit mein neues Kunststoff wirkt aber sehr gut so ist es auch eine geschickheit die man sich anlernen muss.
Und auch wie Florian schon erwähnte: da sind ab und zu Schnitte die einfach nicht gut strecken, passiert mir auch öfters.
Zum Wasserbad möchte ich noch sagen das im Video viele Luftblasen zu sehen sind die entstehen mit AD. Heute Koche ich Wasser zuerst aus und dann sind die Luftblasen verschwunden.
Viel Erfolg heutenachmittag und berichte nochmals, bin gespannt.
Grüße Ronald
Ein Großes Danke an Euch alle :-)
Ich habe fast alles verstanden, bei "Das Gewebe im Block weicher einstellen" von Dir Rolf-Dieter bin ich mir nicht sicher ...
Daher meine Interpretation: Du willst mir sagen, ich soll das AFE-Gemisch anders einstellen, ist das richtig?!?
Wie bin ich vorgegangen:
Ich habe eine 5%, 5%, 90% Lösung AFE eingesetzt, die 90% wurden mit 97% Ethanol realisiert. Nach dem AFE (nach ca. 14 Tagen) wurden die Nadeln in Strassburger Lösung umgesiedelt. Von dort in reinen ISO, welcher auf ca. 50 Grand erwärmt wurde (im Wärmeschrank), Verweildauer in dieser Stufe waren 2 Stunden, eine 2. ISO Stufe folgte ==> 3 Stunden.
Dann ging es in eine Mischung aus ISO und 10 % Paraffin (mit einzelnen Pastillen Bienenwachs zum Steuern der Härte, ich habe im Ende 5% Bienenwachs und 95% Paraffin eingesetzt). Über 8 Stunden habe ich die Paraffinkonzentration schrittweise erhöht (a) durch Verdunstung des ISO und b) durch Zugabe von Paraffin (flüssig, steht flüssig im Heitzschrank bereit.
Überführung in reines Paraffin und Verweildauer wieder 3 Stunden. Dann habe ich den Block gegossen (18 x 28 x 16) und abkühlen lassen und er hat mehrere Tage ausgehärtet.
Trimmung und grobes Vorschneiden mit einer gebrauchten Einmalklinge. Messertausch und finale Schnitte.
Der Block hat keine Einschlüsse, die Schnittfläche glänzt auf der gesamten Fläche und zum Schneiden geht der Block traumhaft (wenn da nur das Einrollen ...)
Ich hoffe damit etwas genauer über meinen Ablauf berichtet zu haben, bitte einfach sagen was ich genauer beschreiben soll, ich reiche das dann gleich nach ...
Das mit dem ziehenden Schnitt war ein Tipp, welchen ich von einem alten Hasen bekommen habe. Ich habe aus diesem Grund so angefangen zu testen. Zu Schneiden ist es so übrigens sehr gut gegangen ==> flächig spiegelnde Fläche im Paraffin, keine Scharten, Kratzer, Ausbrüche ...
Ich habe alle 3 Mikrotome einsatzbereit, aufgebaut ist immer das Leitz Grundschlittenmikrotom, das steht fix auf einem Werkzeugwagen und ich kann es damit in Sekundenbruchteilen einsetzen.
Wenn ich den Tipp von Jürgen sehe, sollte mein Jung Histocut 820 II sicher noch besser geeignet sein.
:-)
Gerhard
PS: jetzt habe man die Infos weitergegeben und gehe wieder einen Raum weiter zum Testen am Objekt :-))
O.k., ich bin einen kleinen Schritt weiter ...
Ich habe bis jetzt 3 Änderungen umgesetzt:
das Wasserbad ich jetzt zwischen 45 und 50 Grad
das Messer steht jetzt 90 Grad zur Schnittrichtung/Nadel
ich habe einen flacheren Winkel zwischen Messer und Block
& sie drehen sich jetzt viel weniger ein und schwimmen fast flach auf der Wasseroberfläche ...
Ich bin aber trotz dem für alle Tipps und Verbesserungsvorschläge dankbar, ich denke da noch einiges an Verbesserungspotential zu haben!!!
:-)
Gerhard
Hallo Gerhard,
die von Dir beschriebene Paraffineinbettung sieht schon einmal gut aus, zumal beim Schneiden sich eine glatte Oberfläche über Paraffin und Objekt einstellt. Nur die Zumischung von Bienenwachs kenne ich eher von handgeschnittenen Paraffinblöcken.
Vielleicht ist das Paraffin jetzt zu weich. Abhilfe könnte Kühlung von Block und Messer bringen.
Ansonsten mit den üblichen Freiheitsgraden probieren die da sind Schnittdicke, Messerwinkel, Schnittgeschwindigkeit, Block und Messer anhauchen usw.
Ich schneide recht wenig bzw. kaum noch Paraffinblöcke, aber bei Deinem Problem war immer die 30%ige Ethanol-Lösung hilfreich und, jetzt wird es nicht ungefährlich und bitte nicht unbedingt nachmachen, auf die Oberfläche einen feinen Haarpinsel leicht und flach ansetzen, der zweite Schnitt bändert dann oft.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Lieber Gerhard,
in einem Punkt sehe ich nicht ganz klar: W a n n rollen sich Deine Schnitte und wie? Rollen sie beim Scheiden oder beim Aufziehen auf den OT? Rollen Sie in Schnittrichtung auf oder verkrunkeln sie irgendwie? Kannst Du ein Photo von einem gerollten Schnitt einstellen?
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Jürgen
Die gute Nachricht, das Problem dürfte gelöst sein :-))
Die Schnitte haben sich vom Messerhalter weg gerollt, das ist beim Schneiden passiert. Durch die Tipps - danke an alle - und etwas nachdenken bin ich jetzt weiter gekommen. Die Kombination der oben beschriebenen 3 Schritte hat mich weiter gebracht. Ich bin zwar noch nicht am Ziel, aber den Schritt habe ich hinter mir ...
Die gute Nachricht ==> der Block war o.k., meine Kombination hat gut funktioniert und auch den Gussrahmen, die Mischung mit Bienenwachs, die Verwendung von ISO , ...
Was ich gelernt habe sind zwei Hauptthemen:
1.) Die Messerstellung, parallel zum Block ist besser wie der ziehende Schnitt den ich zuerst versucht habe & ich hatte das Messer viel zu steil. ich habe mit 15 Grad begonnen und bin jetzt auf 8 Grad herunten. Flacher kann ich mit meinen selbst gebauten Messerhaltern gar nicht gehen. Die Einmalklinge liegt auf einem 8 Grad Keil auf, wobei, dieser Winkel dürfte reichen. Ich werde mir einen leeren Block giessen und am Histocut 820 II testen. Dort kann ich auch noch flacher einstellen. Eigentlich habe ich ja das für genau die Paraffin und PEG-Blöcke gekauft, da aber alle gesagt haben, dass das mit dem Grundschlittenmikrotom auch leicht geht wollte ich mit dem arbeiten. Die Winkelverstellung ist übrigens mit beidseitig geklemmten Messer unkonfortabel. Das geht mit dem Reichert Jung Messerhalter den ich adaptiert habe um ihn bei einseitiger Befestigung einzusetzen viel leichter und auch die Skala ist weit besser ...
2.) Auch die Paraffinblöcke werden wie die nicht eingebetteten Pflanzen mit verdünntem Alkohol geschnitten und auch das Auflegen des Pinsel geht gleich ...
Ich habe aber noch zwei Probleme, eines wo ich glaube die Lösung bereits zu kennen ==> ich halte die Einmalklinge mit einer Aluplatte auf den harteloxierten Messerhalter und der Aluteil hat eine Schräge über die sich der Schnitt schiebt (jetzt dreht er sich ja nicht mehr zurück). Diese Oberfläche ist noch nicht glatt genug und bietet den dünnen Schnitten noch zu viel Wiederstand, ich bin zwar nach dem Fräsen mit einer feinen Schlichtfeile über die Fläche gegangen, aber das reicht nicht. Ich habe Stauchungen im dünnen Paraffin und zerstöre damit teilweise die Schnitte. Da muss ich wohl wie bei einem Mikrotommesser vorgehen und mit 3000er und 8000er Stein drüber gehen. Den Klingenhalter von Detlef für Mikrotome kenne ich, bei diesem ist der Winkel um ca. 10 Grad steiler wie bei meinem. Der funktioniert bei uneingebetteten Pflanzenschnitten sehr gut. Wie Schaut der Keil bei Euren Messerhaltern aus?!? Ich werde Morgen von meinem noch ein Bild nachreichen ...
Das zweite ist der Folgeschritt nach dem Strecken, das Aufkleben mit Eiweisglitzerin. Da gibt es laut Beschreibung viele unterschiedliche Varianten, ich kann jetzt gar nicht genau sagen wie viele ich im 1968er Romeis gelesen habe, es waren mindestens 4 ... Ich habe die mit Erhitzung kurz unter den Schmelzpunkt des Paraffins eingesetzt, bin aber noch sehr unsicher ob die Schnitte darauf halten werden.
Welche setzt Ihr denn da ein und was für Erfahrung habt Ihr damit ... ?!?
Wann und wie löst Ihr das Paraffin auf ==> Xylos, Rotihistol, erhitzten ISO, ... ?!?
Die Fragen gehen nicht aus :-))
:-)
Gerhard
Hallo Gerhard,
ich würde die Schnitte nur mit Wasser aufkleben, müßte auch in Deinen Büchern stehen. Mit Eiweißglycerin handelts Du dir nur noch ein optisch wirksames Medium mit ein.
Zur weiteren Verarbeitung: Rotihistol 2x wechseln, erste Stufe etwas mehr als handwarm erhitzen, Isopropylalkohol 2x wechseln, 1x 94%iger Alkohol, 70%iger Alkohol, 50%iger Alkohol, 30%iger Alkohol, Wasser.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Hallo Rolf-Dieter
Danke, ja habe ich im Romeis gelesen, dort steht aber auch, dass das nicht sicher haelt ...
Ich bin mir nicht sicher ob ich die heutigen Schnitten auf meinen Gewissen habe ...
Ich habe die Schnitte aufgeklebt und fuer Morgen haette ich das Faerben vor. Aber geht das ueberhaupt?!?
Trocknen die Schnitte aus oder verhindert dss Paraffin, ich dachte zuerst ja und jetzt bin ich mir nicht mehr sicher ...
Wie lange kann man den die vorbereiteten Objekttraeger aufheben oder muessen die in einen Faerbetrog eingestellt werden und mit ? bedeckt werden?!?
:-)
Gerhard
Lieber Gerhard,
Ob die Stauchungen im Schnitt wirklich mit der rauhen Oberfläche des Messerhalters zusammenhängen, bezweifele ich ein wenig. Es sei denn, Du meinst die Stelle, an der das Einmalmesser unter dem Oberteil des Messerhalters hervorschaut. Dort ist natürlich ein Sprung in der Höhe, anders als beim Mikrotommesser, denn das Einmalmesser muss ja irgendwie festgezurrt werden. Der stört in der Tat beim Schlittenmikrotom. Mit dem Messerhalter von Detlef geht das aber ziemlich gut. Wenn das das Problem sein sollte, versuche einmal, den Block ein wenig größer zu machen, jedenfalls nicht so, dass das Ende des Schnitts nicht unmittelbar vor dem Sprung zu liegen kommt und beim nächsten Schnitt eine Stauchung entsteht.
8 Grad ist wohl ziemlich das Maximum. Wie steil Du das Messer stellst hängst aber auch ein wenig von der Härte des Blocks und der Stärke des gewünschten Schnittes ab. Wenn die Schnitte beim Schneiden einfach einrollen, liegt übrigens hier meist Du Ursache: Das Verhältnis von Härte des Paraffinblocks , der Schnittstärke un des Winkels stimmen nicht zueinander.
Ohne Eiweißglyc zu schneiden geht wohl bei gut zusammenhängenden dünnen! Schnitten auf saubersten OT. Das ergibt, wenn es gelingt wunderbar saubere Ergebnisse. Wenn Du es sicherheitshalber mit Eiweißglyc. versuchen solltest, würde ich es etwa 1 zu 3 verdünnen mit aqua dest und dann einen! Tropfen wie einen BlutAusstrich mit einem 2. OT ausziehen, so entsteht eine dünne Schicht, die sich auch nicht anfärbt. Klebt ziemlich sicher. Hauptsache ist aber gutes Strecken des Schnitts!. Liegt der faltig auf dem OT schwimmt er weg. Oder Du machst es wie Ronald und fügst dem warmen Streckwasser Eiweißglyc. zu. Das gibt auch einen guten sauberen Untergrund und streckt schön. Ich mache es nach der ersten Methode, weil ich meist drei Schnittbänder auf einen OT lege, meine Schnitte sind mückenklein.
Ich würde den Schnitt gut trocknen lassen. Aufheben kannst Du so ihn unbegrenzt. Sobald Du ihn entparaffiniert hast musst Du aber färben und eindecken.
Viel Erfolg!
Jürgen
Hallo Gerhard,
Deine Fragen hat Dir ja Jürgen Harst soeben beantwortet.
Wenn Du mit den Standardabläufen hinreichend vertraut bist, kann ich Dir ein einfacheres Verfahren für die Verarbeitung von Paraffinschnitten empfehlen, das ich einmal vor Jahren probiert und heute Abend hier im Forum beschrieben habe: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9830.0
Hierbei kannst Du wirklich auf Klebstoff verzichten, die Schnitte können nicht abschwimmen, da sie bis kurz vor dem Einschließen im Paraffin verbleiben. Und in Xylol oder Rothistol ist mir noch nichts aufgeschwommen.
Außerdem ziehen hierbei die Farben intensiver auf, was für die Mikrofotografie durchaus vorteilhaft ist.
Aber arbeite Dich erst einmal im Standard ein, dann erhältst Du auch genügend Vergleiche um für Dich das beste anwenden zu können.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Nachtrag:
Lieber Gerhard,
manchmal hilft gegen das Einrollen auch, einmal vorsichtig mit einem xylolgetränkten Läppchen über die Messerschneide zu gehen.
Schöne Abendgrüße
Jürgen
Hallo Juergen
Das ist ja witzig, ich habe es mit Rotihistol versucht. Die Ursache fuer diesen Versuch, die paraffinspuren am Messerhalter haben die Schnitte gebremst!
Ich musste also gar nicht zum Schleifmittel greifen ...
Ich habe auch zwei neue Bloecke gegossen und dieses Mal nicht bei Raumtemperatur sondern im Eiskasten aushaerten lassen. Leider komme ich die Woche nicht zum Schneiden, ich muss meine Unterrichtswoche vorbereiten. Ab Sonntag unterricht ich eine Woche dad Thema Histogramm :-)
Es hat auch mit Rotihistol gut funktioniert!
:-)
Gerhard
Lieber Gerhard,
je kälter und härter das Paraffin, desto dünner m u s s t Du schneiden, sonst rollt es wieder. Und das Messer nicht zu steil stellen, sonst kriegst Du die typischen Shutter im Block...Kannst Du allerdings auch bekommen, wenn Du zu flach stellst, dann schrammt der Messerhalter statt der Klingenschneide über den Block .
Für die Botanik brauchst Du doch gar nicht so dünn, wie uns Ronald immer in der tierischen Histologie zeigt ......
Schöne Grüße
Jürgen