Platynereis dumerilii - Entwicklungsstadien

[reblaus]

Hallo Jan -

schon mal mit gekreuzten Polfiltern probiert? Muskelfasern könnten da vielleicht sichtbar werden.

Gruß

Rolf

[7an]

Hallihallo,

Für Hox gibt es wohl noch keine Antikörper? Ich stelle mir vor, daß das Bild dann noch genauer wäre, als mit dem Enzym/Substrat.

Das Enzym sitzt ja am Antikörper gegen Hox. Der Vorteil der Enzymumsetzung ist ein Dauerpräparat, da kein Fluoreszensfarbstoff ausbleichen kann.

schon mal mit gekreuzten Polfiltern probiert? Muskelfasern könnten da vielleicht sichtbar werden.

Bisher nicht, glaube im Institut wird mit Polfiltern nicht gearbeitet. Wir Studenten dürfen immerhin die Fluoreszensmikroskope benutzen, aber die richtigen Profis dort arbeiten fast nur am Konfokalen Laser Mikroskop, aber da werden wir noch nicht rangelassen. Ich glaube mit Polfiltern kennt sich dort auch niemand aus, werde aber mal nachfragen. Das Problem ist denke ich, das da wirklich nur bestimmte Strukturen verglichen werden, die man dann auch ausschliesslich sehen möchte, daher stört alles andere im Bild.

Nochmal ein paar Impressionen von heute:



Primär-Antikörper gegen acetyliertes Tubulin, was unter anderem in Axonen von Neuronen vorkommt. Die richtig leuchtenden Stellen sind der Wimpernkranz, ganz zart im inneren sind die ersten 2 Nervenbahnen des Bauchmarks zu erkennen, oben im "Kopf"-Bereich sieht man Neuronen und Nervenbahnen des werdenen Gehirns.


Dasselbe in einer Sicht von apikal.


Hier ein wie ich finde sehr schönes Untertassen Foto.
Eigentlich sollten hier ein Neurotransmitter angefärbt sein, der aber noch nicht zu sehen ist in diesem Entwicklungsstadium. Sehr schön aber die Autofluoreszens der Wimpernkränze und von Drüsen im Kopfbereich.

Schöne Grüße,
Jan

[Oecoprotonucli]

Diese Aufnahmen sind ja nun mal der Hammer! "Protuberanzen einer dunklen Sonne" - selbst falls man nicht wüßte, was das ist, wären diese Bilder sehr anregend!

Für Hox gibt es wohl noch keine Antikörper? Ich stelle mir vor, daß das Bild dann noch genauer wäre, als mit dem Enzym/Substrat.

Das Enzym sitzt ja am Antikörper gegen Hox. Der Vorteil der Enzymumsetzung ist ein Dauerpräparat, da kein Fluoreszensfarbstoff ausbleichen kann.

Ach ja, da habe ich wieder einmal schneller geschrieben als gedacht ich meinte wohl: Fluoreszenzgekoppelten Antikörper.
Denn ich glaube und wollte sagen, dass der Nachteil eben ist, dass leicht zu viel Substrat vor Ort gebildet wird, so dass sich die Färbung leicht zu breit macht und zu stark wird und Anderes überdeckt, wenn man nicht aufpasst. Mit einem Fluorophor pro Antikörper wäre das Bild - glaube ich - wahrscheinlich etwas schärfer (aber wie Du sagst, dann wohl leider auch schneller weg, also ausgeblichen...)

[Oecoprotonucli]

Primär-Antikörper gegen acetyliertes Tubulin, was unter anderem in Axonen von Neuronen vorkommt. Die richtig leuchtenden Stellen sind der Wimpernkranz, ganz zart im inneren sind die ersten 2 Nervenbahnen des Bauchmarks zu erkennen, oben im "Kopf"-Bereich sieht man Neuronen und Nervenbahnen des werdenen Gehirns.

...Du setzt also voraus, dass wir wissen, dass eben die Wimpern eine große Menge und hauptsächlich Mikrotubuli enthalten (Stichworte: "Axonem", "9+2-Muster")...

[7an]

Hallo mal wieder.

Ach ja, da habe ich wieder einmal schneller geschrieben als gedacht ich meinte wohl: Fluoreszenzgekoppelten Antikörper.
Denn ich glaube und wollte sagen, dass der Nachteil eben ist, dass leicht zu viel Substrat vor Ort gebildet wird, so dass sich die Färbung leicht zu breit macht und zu stark wird und Anderes überdeckt, wenn man nicht aufpasst. Mit einem Fluorophor pro Antikörper wäre das Bild - glaube ich - wahrscheinlich etwas schärfer (aber wie Du sagst, dann wohl leider auch schneller weg, also ausgeblichen...)

Vielleicht spielt es auch eine Rolle das die Enzymfärbung günstiger ist. Wenn man sich mit unseren Dozenten unterhält kann man sich nur die Haare raufen was da noch für Mittel pro Kopf übrigbleiben. Trotzdem bin ich froh das wir doch motivierte Lehrende haben die uns einiges bieten.

...Du setzt also voraus, dass wir wissen, dass eben die Wimpern eine große Menge und hauptsächlich Mikrotubuli enthalten (Stichworte: "Axonem", "9+2-Muster")...

Mein Fehler, ich werde mich in Zukunft bemühen mehr Erläuterungen zu geben.

Mal weiter im Thema:

Für unser Versuchsprotokoll müssen wir nun also die Auswirkungen darstellen, die das künstliche Ausschalten des Signaltransduktionsweges Notch+Delta auf die Frühentwicklung von Platynereis dumerilii hat. Eine Signaltransduktion ist eine Möglichkeit der Zell-Kommunikation. Im Falle von Notch und Delta ist Delta das signalgebende Protein und Notch das signalempfangende, also der Rezeptor. Da Delta ein Protein ist das fest in der Zellmembran verankert ist gehört diese Art der Kommunikation zu den sogenannten juxtakrinen Kommunikationswegen. Es gibt natürlich auch lösliche Faktoren die dann zu para- oder endokrinen Kommunikationswegen zugeordnet werden. (Wikipedia Links: Signaltransduktion, Notch-Signalweg,


Quelle: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Notchccr.gif

Notch und Delta sind in vielen Organsimen wichtig in der Differenzierung bestimmter Strukturen in der Entwicklung. Bei Drosophila spielt es beispielsweise in der Bildung des Nervensystems eine Rolle. Bei Arthropoden ist eine Mitwirkung an Segmentierungsprozessen beschrieben. Bei Platynereis dumerilii soll dieser Signalweg nun ausgeschaltet werden und die Auswirkungen auf die Morphologie, das Nervensystem, die Muskulatur und einen bestimmten Neurotransmitter untersucht werden. Zum ausschalten des Signalweges gibt es mehrere Möglichkeiten. Nach dem "andocken" von Delta an Notch erfährt das Protein eine Konformationsänderung, das heißt es ändert seine dreidimensionale Form. Dadurch wird ein anderes Protein aktiviert, eine sogenannte Protease, deren Aufgabe es ist Proteine an bestimmten Stellen zu schneiden (im Bild Proteolysis). Das abgeschnittene Stück NICD (Notch intracellular domain) wandert dann in den Zellkern und nimmt Einfluss auf die Aktivität bestimmter Gene. Bei uns wurde die Kaskade aufgehalten, indem die Protease inhibiert wurde.

Hier nun die direkte Gegenüberstellung der Bilder in denen Delta+Notch aktiv und inaktiv ist. Fangen wir an mit der Markierung der Muskulatur durch Phalloidin.



Links die unbehandelten Larven, rechts die bei denen Delta+Notch ausgeschaltet ist.
Die Bilder A+B sind von 34 Stunden alten Larven in anterior-posteriorer Ansicht, man schaut quasi auf den Popo. Die großen "Löcher" sind Lipidtropfen, von denen die Larve sich anfangs ernährt. Mit dlm ist die dorsale (rückwärtige) Längsmuskulatur gekennzeichnet, man sieht gut die einzelnen Muskelfasern. Im Prinzip sind keine Unterschiede zu erkennen.

Die Bilder C+D zeigen 58 Stunden alte Larven, ebenfalls in dorsoventraler Ansicht wobei die Schärfeebene im ventralen Bereich liegt. Durch vlm wird die ventrale Längsmuskulatur gekennzeichnet, mvlm der medial ventrale Längsmuskel, om sind Schrägmuskeln und ppm die Parapodialmuskeln. Auffallend ist das Fehlen von ppm und mvlm im Bild D.

Die Bilder E+F zeigen 58 Stunden alte Larven, ebenfalls in dorsoventraler Ansicht wobei die Schärfeebene im dorsalen Bereich liegt. Die Pfeile in E zeigen die Ansatzmuskulatur der Borsten, die sogenannten Borstentaschen. Diese fehlen im Bild F.

Man kann also davon ausgehen das Delta+Notch mit der Differenzierung der Borsten zu tun hat. Was natürlich schon bekannt ist, aber das ganze dient ja zu meinen Ausbildungszwecken.

Schönen Gruß,
Jan

[koestlfr]

Hallo Jan!

Tolle fotos, sehr interessanter Beitrag!

Bei welcher Anregungungsfrequenz fluoresziert der Farbstoff?

Liebe Grüße

Franz

[7an]

Hallo Franz,

vielen Dank für das Lob.

Der im letzen Beitrag verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist Fluorescein isothiocyanate (FITC), angeregt bei 495 nm, Emission bei 521 nm.

Schönen Gruß,
Jan

[koestlfr]

Hallo Jan!

Hey, da kann man ja sogar ohne Hg-Dampf mit "Blaulicht arbeiten!

Ich finde es toll, dass Du so ambitioniert Dein Studium betreibst! Wie mein älterer Sohn! :-))

Liebe Grüße aus Österreich

Franz