Wie Bakterien hervorheben/differenzieren?

MikroTux · April 01, 2015, 18:22:35 NACHMITTAGS

Hallo,
mich beschäftigt die Frage, wie ich in einem nassen Suspensionspräperat einer Bodenprobe, die unter dem Deckglas auf dem Objektträger ausgestrichen ist, Bakterien besser von Tonteilchen (Mineralischer Bodenanteil bis 0,002mm Größe) unterscheiden kann.

Es gibt zwar Leute die der Ansicht sind es wäre nicht tragisch, diese mitzuzählen, da man immer denselben Fehler macht. Da bei uns wohl mehr Ton im Boden ist, dessen Anteil auch schwankt, würde ich das doch gerne unterscheiden können.

Wäre es möglich, mit einer Färbung Bakterien (aller Art) und Tonteilchen in der Durchlichtmikroskopie von anderen Teilchen gleicher Größe unterscheiden zu können? Welche Verfahren/Techniken wären dafür geeignet?

Ich nach meiner Literatur[Rudolf Drews- Mikroskopieren als Hobby], habe an Färbungen mit Kopierstift, Tusche, Metylenblau oder Karbolfuchsin gedacht. Bevor ich aber wild drauflos experimentiere und am Ende auf einem unbrauchbaren aber zu entsorgenden Chemikalien Cocktail sitze, habe ich gedacht, ich frage zuerst lieber hier, nach Erfahrungen mit dem Einfärben [oder anderen Kontrastmethoden] zum Hervorheben von Bakterien.
Für Anregungen bin ich dankbar, am liebsten solche Methoden und Techniken die mit einem klassischen CH-2 Mikroskop von Olympus ohne großen Aufwand möglich sind.
vielen Dank,
Frieder

Podsol · April 01, 2015, 20:19:49 NACHMITTAGS

Hallo Frieder,

wäre es möglich die Bakterien mittels (weiterer/erneuter/längerer) Sedimentation vom Ton (<0,002 mm ) abzutrennen?

Schönen Abend,

Flo

Edit: Beim Ton war eine Null zuviel.

treinisch · April 01, 2015, 22:21:32 NACHMITTAGS

Hallo,

zwei Dinge:

Zitat von: Podsol in April 01, 2015, 20:19:49 NACHMITTAGS
wäre es möglich die Bakterien mittels (weiterer/erneuter/längerer) Sedimentation vom Ton (bzw. eigentlich Grobschluff, da Ton <0,0002 mm ist) abzutrennen?

gibt es dafür eine Quelle? 0,2 µm? Das habe ich noch nie gehört!

Zur Färbung: Was spricht gegen einen der Farbstoffe die für die Gram-Gegenfärbung verwendet werden?

vlg

Timm

MikroTux · April 01, 2015, 23:29:21 NACHMITTAGS

Hallo Floh,

Zitat von: Podsol in April 01, 2015, 20:19:49 NACHMITTAGS
wäre es möglich die Bakterien mittels (weiterer/erneuter/längerer) Sedimentation vom Ton (bzw. eigentlich Grobschluff, da Ton <0,0002 mm ist) abzutrennen?

Das habe ich noch garnicht durchdacht. Feine Tonpartikel bleiben auch mehere Tage in der schwebe, denke da geht die Repräsentativität für die ursprüngliche Probe verloren. Jetzt habe ich in einer Probe von letzter Woche -die inzwischen einigermasen sedimentiert ist- nochmals einen Tropfen auf den Objektträger pipetiert. Als Anfänger ist man immer wieder überrascht, wo alles Bakterien zu finden sind, nur Tonteilchen sind auch noch immer mit von der Partie, verbessert das Trennungsproblem nur graduell.

@Timm,

Zitat von: treinisch
Zur Färbung: Was spricht gegen einen der Farbstoffe die für die Gram-Gegenfärbung verwendet werden?

Ich weis nicht, ob etwas gegen die in der Gramfärbung verwendeten Farbstoffe spricht. Deshalb frage ich ja, habe darin keinerlei Erfahrung. Die ganze Gram-Färbung schien mir zu aufwendig, da ich keine Typen unterscheiden brauche. Für Anregungen das möglichst einfach zu machen, bin ich daher dankbar.

reblaus · April 01, 2015, 23:54:24 NACHMITTAGS

Hallo -

du brauchst nicht die (kompliziertere) GRam-Färbung, sondern nur die (einfacher) Gegenfärbung, die m.o.w alle Bakterien färbt!

MikroTux · April 02, 2015, 00:53:47 VORMITTAG

Zitat von: reblaus in April 01, 2015, 23:54:24 NACHMITTAGS
Hallo -

du brauchst nicht die (kompliziertere) GRam-Färbung, sondern nur die (einfacher) Gegenfärbung, die m.o.w alle Bakterien färbt!

Wenn ich mir die Abfolge der Gram-Färbung ansehe, verstehe ich das richtig, daß also, eine Färbung mit Karbol-Fuchsin mal zu probieren wäre?

Heino Lauer · April 02, 2015, 08:43:41 VORMITTAG

Hallo,

die Gramfärbung ( aber auch die Einfachfärbungen) macht man doch eigentlich an einem hitzefixierten Präparat. Du schreibst eingangs, ein nasses Suspensionspräparat sei unter einem Deckglas ausgestrichen. Beobachtest Du denn nun an einem feuchten Präparat, also Lösung unter Deckglas, oder an einem Ausstrich, der getrocknet ist? Für die konventionellen Bakterienfärbungen wäre der Ausstrich die Voraussetzung, dann kommt die Fixierung und danach die Färbung.

Muss Dein Präparat während der Untersuchung feucht bleiben?

Viele Grüße

Heino

Podsol · April 02, 2015, 09:05:01 VORMITTAG

Morgen miteinander,

Ton ist natürlich <0,002 mm, bzw. 2 µm. Die Tonfraktion wird nochmal unterteilt, wobei der Feinton < 0,2 µm. Quelle: Ad-hoc Arbeitsgruppe Boden: Bodenkundliche Kartieranleitung (2005).

Die Sedimentationsgeschwindigkeit einer tonigen Suspension kann deutlich beschleunigt werden, wenn die Leitfähigkeit der Suspension >50 µS ist (Zugabe geringer Mengen an Kochsalz (falls die Bakterien damit zurechtkommen), bzw. Verwendung von Leistungswasser).

Schöne Feiertage,

Flo

Dr. Jekyll · April 02, 2015, 12:04:56 NACHMITTAGS

Hi Bakterienfreunde,

wenn es darum geht den Bakterientiter zu bestimmen würde der Mikrobiologe eine Verdünnungsreihe mit anschließender Anzucht auf Agar-Nährböden empfehlen. So können die Keime leicht ausgezählt werden. Es ist zwar keine mikroskopische Methode, aber dabei stört die Verunreinigung durch Ton nicht.

Beste Grüße
Harald

P.S.: DIFCO-Agar in kleinen Mengen kann ich besorgen

MikroTux · April 02, 2015, 23:53:38 NACHMITTAGS

Zitat von: Heino Lauer in April 02, 2015, 08:43:41 VORMITTAG
die Gramfärbung ( aber auch die Einfachfärbungen) macht man doch eigentlich an einem hitzefixierten Präparat. Du schreibst eingangs, ein nasses Suspensionspräparat sei unter einem Deckglas ausgestrichen. Beobachtest Du denn nun an einem feuchten Präparat, also Lösung unter Deckglas, oder an einem Ausstrich, der getrocknet ist? Für die konventionellen Bakterienfärbungen wäre der Ausstrich die Voraussetzung, dann kommt die Fixierung und danach die Färbung.

Muss Dein Präparat während der Untersuchung feucht bleiben?

Das ist eine gute Frage. Es geht darum, das Mikroleben im Boden als Gesamtes zu beurteilen. Um zu erkennen welche Protozooen u.a. vorkommen das nasse Präparat. Ich habe dannach gefragt, da es für mich das einfachste wäre, direkt so eine Probe zu färben. Es ist allerdings auch denkbar (müsste mir einen Brenner besorgen) aus dem Reagenzglas mit der Bodnesuspension auf einem 2 Träger eine weitere Probe zu nehmen, die man dann fixiert. Grundsätzlich bin ich da offen dafür, bevorzugen würde ich einfachere, weniger Aufwändige Lösungen.

hebi19 · April 03, 2015, 09:27:29 VORMITTAG

Zitat von: MikroTux in April 02, 2015, 23:53:38 NACHMITTAGS
....Um zu erkennen welche Protozooen u.a. vorkommen ......Es ist allerdings auch denkbar (müsste mir einen Brenner besorgen) ..... eine weitere Probe zu nehmen, die man dann fixiert.

Hallo Frieder

Ich befürchte, dass das Eine oder Andere bei Dir durcheinander kommt. Protozoen sind sogenannte Eukaryonten, also "höhere Lebewesen" mit Zellkern und auch sonst aus Bausteinen/Elementen in großer Varianz aufgebaut. Die kann man in keiner Weise "Hitze fixieren" (wozu Du scheinbar den Brenner brauchen würdest ?) wie man das mit Bakterien tut. Wenn du Protozoen identifizieren willst ist vorheriges Fixieren und Färben eher kontraproduktiv.
Diese Lebewesen gehören selbstverständlich zum "Mikroleben des Bodens". Eine Beurteilung geht quasi nur im "Frischpräparat", wo sie hauptsächlich durch ihre Bewegung auffallen und sich so von den Bakterien unterscheiden.

Bakterien sind demgegenüber "sehr einfach" aufgebaute Lebewesen (ohne Zellkern und aus vergleisweise wenigen Bausteinen). Einige sind beweglich, andere bewegen sich nicht. Sie sind im "großen und ganzen" deutlich kleiner als die "Protozoen". Im (Licht-)Mikroskop kann man sie NICHT identifizieren (im Sinne von "die Art bestimmen") und kaum beurteilen. Man erkennt einige wenige Grundformen (wie Stäbchen, Kokken, Spirillen etc), kann sonst aber nichts zuordnen oder gar bestimmen oder quantitativ zählen. Mit Phasenkontrast kann man sie auch ohne Fixierung und Färbung erkennen. Eine Beurteilung in Bezug auf "wie viele gibts da in 1 ccm Boden" geht nur über die beschriebene Ankultur auf Nährböden. Dabei werden dann auch die Bakteriensporen erfasst, welche schon gar nicht im Mikroskop eindeutig identifiziert werden können. QUALITATIV (also z.B. "es gibt hier Bakterien und die sehen aus wie Stäbchen") erkennt man sie (besser : einige der vorhandenen) eben mit Phasenkontrast oder Färbung. Jegliche Zählversuche laufen wegen der unsicheren Erkennung aber ins Leere.

Was heißt also für dich, die "Mikroleben im Boden als Gesamtes zu beurteilen"?? Beurteilen in Bezug auf was ?? Und wie weit geht für dich "das Mikroleben"?? Alles "Mikroleben" zusammen in einem Präparat mit dem normalen Lichtmikroskop zu "beurteilen" geht schwierig bis sehr eingeschränkt oder gar nicht.

Grüße
Martin

EDIT: PS - in einer Probe, welche "eine Woche sedimentiert" hat sich die Mikrolebewelt so weiterentwickelt, dass eine Beurteilung des Ausgangsmaterials nicht mal eingeschränkt mehr möglich ist !!

piu58 · April 03, 2015, 09:41:35 VORMITTAG

> Man erkennt einige wenige Grundformen (wie Stäbchen, Kokken, Spirillen etc), kann sonst aber nichts zuordnen oder gar bestimmen oder quantitativ zählen

Wie schon gesagt, grampositiv oder gramnegativ lässt sich noch recht einfach bestimmen. Das sagt etwas über die Struktur der Zellwand aus.

Dr. Jekyll · April 03, 2015, 10:03:10 VORMITTAG

Hallo Frieder,

Mir ist unklar was, wie und wofür Du deine Proben auszählen möchtest. Auf einem Objektträger ausgestrichene Proben sind zum Auszählen ungeeignet. Für Bakterien verwendet man spezielle Zählkammern. Für andere Einzeller benötigt man andere Zählkammern. Die Zählkammern unterscheiden sich in ihrem Volumen, welches jeweils genau definiert ist. Mit Ton oder anderen Mineralien verunreinigtes Material kann diese Zählkammern aber schnell ruinieren, da sie hierdurch verkratzt werden.
Wenn Du etwas genauer erklärst was Du vor hast, kann dir besser weiter geholfen werden.

Beste Grüße
Harald

MikroTux · April 04, 2015, 01:01:58 VORMITTAG

Hallo alle,
Wenn ein Boden frisch besiedelt wird, sind daran erstmal Bakterien beteiligt. Je weiter die Sukzession Richtung Wald fortschreitet, desto mehr sind dann Pilze am Nährstoffaustausch beteiligt. In einer Probe schaut man, wieviel Biomasse Bakterien auf welche Biomasse Pilzhyphen kommen, um daran abzulesen, welcher Zustand der Boden hat. Dabei geht es nicht um die letzte Dezimalstelle, sondern eher um Zehnerpotenzen. Die Meisten Kulturpflanzen bevorzugen mehr oder minder einen ausgewogenen Bereich. In den Bodenproben man will daran dann ablesen, welche Bodenbeeinflussung ihn dann in die für gew. Bepflanzung passende Richtung verändert. Deshalb die Frage nach einer groben Mengenbestimmung der Bakterien-Biomasse, Artbestimmung ist nicht notwendig.

Zusätzlich schaut man, welche Protozooen, Nematoden u.a. man vorfindet, da dies weitere Hinweise über den Zustand des Lebens im Boden gibt. Ich finde das einen interessanten Ansatz, weshalb ich mich damit beschäftige, und das ausprobieren will. Ich hoffe, man kann das verstehen, ganz genau bin ich damit auch noch nicht vertraut, da ich am probieren, und mich einarbeiten bin.
Im Internet findet man auf dieser Seite etwas dazu, wobei einige Links inzwischen überholt sind und mehr hierher zeigen müssten (alles auf Englisch).