Fluoreszenz. Herstellung Stammlösung von Acridinorange

[mikropit]

Hallo an alle Fluoreszenzmeister!
Ich will nun nicht blos mit Primärfluoreszenz arbeiten, sondern auch mit Sekundärfluoreszenz. Dazu habe ich mir Acridinorange bestellt. Nun weiss ich leider nicht, wie ich aus dem Pulver die Stammlösung herstellen muss. Die notwendigen Verdünnungen für die verschiedenen Anwendungen, auch Vitalfärbungen, kenne ich. Da gibt es ja eine sehr grosse Bandbreite und viele Möglichkeit zum experimentieren.
Für eine Rezept zum Anmischen wäre ich sehr dankbar. Im WEB habe ich nichts gefunden.
vG Peter

[jochen53]

Hallo,

im "Romeis" steht unter Ziffer 798: 1 Teil der Stammlösung (= 1 g Acridinorange auf 10.000 ml dest Wasser = 10 Liter) wird zur Färbung mit 9 Teilen einer Phosphatpufferlösung verdünnt. Am besten eine Analysenwaage nehmen und weniger ansetzen.

Phosphatpufferlösung:

Lösung a) 9,072 g KH₂PO₄ in dest. Wasser lösen und  auf 1000 ml auffüllen.
Lösung b) 9,465 g Na₂HPO₄ in dest. Wasser lösen und  auf 1000 ml auffüllen.
Für die Pufferlösung mischt man 230 ml der Lösung a) mit 40 ml der Lösung b); pH = 6,0.

Zur Differenzierung nimmt man da noch 0,1 m CaCl₂-Lösung: 11,099 g CaCl₂ in dest. Wasser lösen und  auf 1000 ml auffüllen.

Viele Grüße, Jochen.

[mikropit]

Vielen Dank!!
Ach je mi ne. Ich habe geglaubt nur Acridinorange verdünnen fertig. Wo bekommt man die anderen Chemikalien her? Welchen Zweck hat die Pufferlösung?
vG Peter

[Peter Reil]

Hallo Peter,

ich nehme ganz wenig Pulver und ganz viel Wasser. Für meine Bedürfnisse hat es bisher gereicht. 

Freundliche Grüße
Peter

[Jürgen H.]

Hallo Peter,

die Pufferlösung hat den Zweck, den pH Wert in einem bestimmten Bereich konstant zu halten. Mit der Pufferlösung kannst Du einstellen, wie sauer oder wie basisch die Lösung dauerhaft sein soll.

Beim Acridinorange hängt das Färbeverhalten von der Eigenart der einzelnen anzufärbenden Strukturen u n d dem pH Wert der Färbelösung ab. Das wird für diagnostische Zwecke ausgenutzt. Außerdem kann ein Puffer dazu dienen, lebende Zellen für die Dauer der Untersuchung möglichst ohne Veränderungen  zu erhalten.

Wenn Du Lust hast, schau einmal hier herein.

https://www.researchgate.net/post/What_is_the_role_of_pH_in_acridine_orange_staining

Für unsere Hobbyzwecke kannst Du, wie Peter schrieb, den Puffer weglassen. Ein paar Handschuhe wären wichtiger.

Du könntest auch versuchen, die Färbelösung sukzessive etwas mit Essigsäure anzusäuern und die Ergebnisse vergleichen. Etwas Essigessenz tropfenweise zugeben.

Schöne Grüße

Jürgen

[mikropit]

Vielen Dank, der Link ist ja sehr interessant
Peter Gehrlach

[mlippert]

Auch wenn das Thema alt ist, vielleicht braucht ja nochmal jemand einen Tipp:
Die beste Unterscheidung zwischen Pro- und Eukaryoten erreicht Acridinorange im sauren Bereich. Standard sind 1% Essigsäure. Die ist überall verfügbar und man braucht keinen weiteren Puffer. Aber Achtung: Erythrozyten überleben das nicht und sind danach nur noch als Ghosts zu sehen, wenn überhaupt.
Färbt man bei pH 7 / Leitungswasser sind nahezu alle nukleinsäure/kernhaltigen Zellen orange. Erythrozyten bei Tierarten ohne Kern sind blassgrün. Dasher ideal um nach Bakterien in Blutausstrichen zu suchen.

Granulozyten haben so dicht gepackte Nukleinsäuren im Kern, dass sie teilweise ebenfalls orange Kerne haben.