Botanik: Mehliger Salbei (Salvia farinacea): untere Epidermis 'rangezoomt (REM)*

[Christian3000]

Liebe Mikroskopiker,

kürzlich habe ich wieder einige Aufnahmen am REM gemacht, diesmal mit kleinerem Arbeitsabstand (12mm) und 30kV, da ich sehen wollte ob ich eine höhere Auflösung erreichen kann als mit meinem sonst üblichen Arbeitsabstand (34mm). Leider sehe ich da keinen Unterschied, allerdings hatte ich etwas zu kämpfen mit der geringeren Tiefenschärfe, wie man an einigen Aufnahmen sehen kann.

Das Objekt war diesmal das Blatt des Mehligen Salbeis, in Kakodylatpuffer/Glutardialdehyd fixiert, in aufsteigender Alkoholreihe entwässert, in Aceton überführt und kritisch Punkt getrocknet. Gesputtert wurde mit Platin. Das Präparat habe ich allerdings nicht selbst hergestellt, sondern von Stefan bekommen, vielen Dank an dieser Stelle!

Ihr seht schon, mir gefallen die "Zoomfahrten" recht gut, von der Übersicht ausgehend immer tiefer hineingezoomt.

Die Vergrößerungsangaben beziehen sich auf den Fotomonitor des REMs, der misst ca.  11.5cm x 8.5cm.

Hier also das Übersichtsbild, 18.7x: Man sieht schon bei dieser geringen Vergrößerung dass die Tiefenschärfe gering ist (oben und unten im Bild):


Sehr schön sieht man die Behaarung, besonders ausgeprägt entlang der Blattadern. Da wollen wir etwas genauer hinschauen.

Vergrößerung 39x: Auch hier ist die Bildmitte scharf, nach links hin lässt die Schärfe nach, da der Abstand außerhalb der Tiefenschärfe liegt. Nun werden auch kugelförmige Strukturen sichtbar, wohl Ölbehälter, die ätherische Öle enthalten, die durch Reiben des Blattes freigesetzt werden und so schön duften. Sind diese Kugeln die Enden von kurzen Drüsenhaaren? Man sieht es nicht genau, ob da noch ein Stielchen daruntersitzt. Interessanterweise gibt es kleine und große Kugeln.


Vergrößerung 65.5x: Einige der Ölbehälter sind defekt. Ganz klein erahnt man schon die Epidermiszellen...und...


...und, ja, Spaltöffnungen. Auch haben die Haare eine rauhe Oberfläche. 156x vergrößert.


Das möchten wir genauer sehen. Ölbehälter, Haare und Spaltöffnungen bei 503x. Nun erkennt man kurze Stielchen unter den kleinen Kugel, also sind das wohl Drüsenhaare. Die großen Kugeln scheinen vierteilig zu sein. Da muß ich mal recherchieren wie diese gebildet werden. Stielchen darunter kann ich nicht erkennen. Man sieht aber nun sehr schön die gelappte Begrenzung der Epidermiszellen. Auch hier hatte ich wieder mit der Schärfe zu kämpfen, sorry dafür.


Vierteilige Ölbehälter ? Ranzoomen auf 1010x, man sieht es aber nicht sehr deutlich. Das REM bildet eben die Oberfläche ab; mit einem Lichtmikroskop könnte man hier vielleicht mehr erkennen. Also: Je nachdem, was man sehen möchte, braucht man das dafür passende Instrument. Generell "besser" oder "schlechter" gibt es somit nicht, sondern nur "geeigneter" für den jeweiligen Zweck.


Einen letzten Zoomblick werfen wir noch auf einen Ölbehälter, bei 2300x. Hier sieht man wieder gar keine Vierteilung, aber man kann in eine geöffnete Spaltöffnung hineinschauen.


Eine geschlossene Spaltöffnung bei 2720x:


Näher rangeschaut bei 10000x: Hier tut sich das REM schon schwerer noch richtig scharf zu sein. Ist halt schon etwas betagt. Geboren 1986 :-)


Hier eine geöffnete Spaltöffnung bei 2300x:


Und näher an eine andere offene 'rangeschaut bei 7000x:


Nun noch ein Blick auf die Basis eines Haares. Diese Bilder sind nicht besonders, aber ich zeige sie doch noch, da man die geringe Tiefenschärfe hier in zwei verschiedenen Einstellungen der Fokusebene gut erkennt: Im oberen Bild ist das Haar selbst scharf, im unteren eher der Bereich in den unteren 20% des Bildes. 5000x vergrößert.



Das war's soweit, meine neue Kathode scheint generell zu laufen.
Viel Spaß beim Betrachten und ein schönes Wochenende,
viele Grüße,
Christian

[wilfried48]

Das war's soweit, meine neue Kathode scheint generell zu laufen.
Viel Spaß beim Betrachten und ein schönes Wochenende,

Hallo Chistian,

dem kann ich nur beipflichten. Die Bilder sind sehr gut, was vor allem auch an der guten Präparation ist.
Noch eine Frage zum Gerät. Wie hoch sind die Unterhaltskosten ? Was kostet z.B. so eine Ersatzkathode woher beziehst du die und wie
lang hält sie. Du darfst gerne auch per PN antworten. Der Hintergrund meiner Frage ist, dass mein Institut
in absehbarer Zeit ein Philips ESEM XL30 abzugeben hat und ich liebäugle es privat oder mit dem Verein weiterzubetreiben.

viele Grüsse
Wilfried

[Ronald Schulte]

Christian,

Sehr schöne Bilder. Ein REM wäre sicher was für ich aberrrrr...!

Grusse Ronald

[Oecoprotonucli]

Hallo Christian,

wirklich sehr interessant! Ich weiß nicht, wie schwer oder einfach es ist, die Strukturen zu erhalten, aber es scheint mit Deiner Fixierungsmethode gut gelungen zu sein! Besonders die beiden vermutlichen Öl-Behälter sind interessant! Vielleicht kann hier noch jemand mehr über diese erzählen? Auch müsste ich mal nachlesen, ob ätherische Öle eigentlich anlocken oder abstoßen sollen und was sie der Pflanze sonst noch so bringen.

Viele Grüße

Sebastian

[Peter V.]

Hallo Christian,

sehr schöne Bilder! Danke für deine Beiträge. Schade, dass hier im Forum so wenig REM-Bilder gezeigt werden. Ich muss auch immer wieder feststellen, dass mir die originären REM-Bilder besser gefallen als die colorierten Werke, die man in populärwissenschaftlichen Magazinen findet.

Herzliche Grüße
Peter

[Fahrenheit]

Lieber Christian,

schön, dass Du uns hier immer mal wieder botanische REM Aufnahmen zeigst. Sie setzen bekanntes aus der Hellfeld(Auflicht-)Mikroskopie in ein ganz anderes Licht, zumal die Bilder sehr dreidimensional wirken. Gerne mehr davon!

Herzliche Grüße
Jörg

[Oecoprotonucli]

Hallo zusammen,

wozu gibt's in diesem schönen Forum eine schöne Linkliste Botanik? Erschöpfende Antworten habe ich zwar dort noch nicht gefunden, aber man könnte den Drüsenhaaren etc. anhand dessen weiter auf den Grund gehen:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22867.0

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=11214.msg82403#msg82403

Es ist eine andere Salbei-Art. Und in den zitierten Fäden habe ich bisher nur die Haare sowie einen Typ von Drüsenhaaren gesehen, der gestielt ist, also wohl eher den hier gezeigten kleineren "Kugeln" entspricht. Die größeren "Kugeln" sind entweder in den anderen Fotos nicht sichtbar oder bei diesen Salbei-Arten nicht vorhanden?

Besten Gruß

Sebastian

[Eckhard]

Hallo,

Schöne Bilder. Für die höher vergrößerten Aufnahmen würde ich näher rangehen. 33 mm Arbeitsabstand sind bei der Vergrößerung schon heftig, ich arbeite i.d.R. mit einem Zehntel.

Wilfried, ich weiß nicht, was für eine Elektronenquelle in dem XL30 drin ist, aber Wolfram Kathoden für Philips kosten etwa 35€. Bei guter Behandlung kannst Du da sicherlich ein paar Monate damit arbeiten, denn Du wirst ja nicht 8 Stunden am Tag mikroskopieren. Auch musst Du ja das zweite Maximum nicht ganz ausreizen, das verlängert die Lebensdauer erheblich.

Herzliche Grüße
Eckhard

[Fahrenheit]

Lieber Christian,

so, zurück am heimischen Rechner habe ich auch den Link in die Liste Botanik gebastelt.

Lieber Sebastian,

in Christians Aufnahmen erkennt man ein einfaches Haar (dass vermutlich aber auch aus mindestens zwei Zellen besteht) und zwei Drüsenhaare: die kleinen gestielten und die großen, die etwas in die Epidermis eingesenkt sind. Das passt soweit.
Besonders die letzteren sind in Schnitten nur sehr schwer und mit viel Glück darstellbar, da sie wegen ihrer Größe oft zerschnitten werden oder gar abreissen oder im Chemie-Bad der Präparation einfach platzen.

In meinem Beitrag (Dein zweiter Link) sehen wir zudem den Spross von Salvia officinalis, an dem der große Drüsenhaar-Typ meines Wissens nach gar nicht vor kommt. Das Blatt aus dem ersten Thread ist auch Salvia officinalis, also beide leider nicht direkt vergleichbar.

Trotzdem finde ich, dass die REM Aufnahme die Schnitte auch der anderen Salbei-Art leichter verständlich macht, zumal auch die kleineren, gestielten Drüsenhaare bei der Präparation meist "verschrumpeln". Spannend wäre zu sehen, ob die langen, spitzen Haare bei S. farinacea aus nur einer Zelle bestehen. Bei S. officinalis sind sie in aller Regel zweizellig. Christians Interpretation ist korrekt: beim Reiben des Blattes geben die Drüsenhaare ihren Inhalt, die typischen ätherischen Öle, frei.
Bleibt nur die Frage offen, ob die großen Drüsenhaare tatsächlich mehrzellig sind. 

Euch beiden herzliche Grüße
Jörg

[Christian3000]

Hallo,

vielen Dank zunächst für die vielen positiven Kommentare, es freut mich dass Euch die Aufnahmen gefallen.

Zu den Präparaten: Sowohl den Mehligen Salbei als auch die im anderen Post gezeigte Zitronenmelisse habe ich nicht selbst präpariert sondern fertig bekommen. Die Präparation nach dem Universalprotokoll erfordert bedenkliche Chemikalien, mit denen man in einem Labor problemlos umgehen kann (Abzug, geeignete Entsorgungswege), zu Hause möchte man dies wohl nicht tun, hier nochmal die Schritte:
- Fixierung in einem Puffer aus Kakodylat (Salz der Dimethylarsensäure) mit Glutardialdehyd (muss man im Kühlschrank aufbewahren)
- u.U. noch Behandlung mit Osmiumtetroxidlösung; sehr giftige Schwermetallverbindung. Fixiertes Gewebe wird tiefschwarz durch reduziertes Osmium. OsO4 hat einen hohen Dampfdruck, wenn diese Dämpfe die Hornhaut treffen, wird auch sie tiefschwarz, was für den Mikroskopiker nachteilig ist (sorry für den geschmacksarmen Scherz, aber es stimmt wohl)
- die nun folgende aufsteigende alkoholreihenund die Überführung in Aceton sind eher problemlos
- Trocknung: Ein üblicher Weg ist die Kritisch-Punkt-Trocknung (CO2 bei 80 bar)

Ich möchte versuchen eine wenig giftige Methode zu finden, denn es wird Zeit für weitere biologische Objekte...

@Wilfried: Die Unterhaltskosten setzen sich bei mir wie folgt zusammen: fliessendes Wasser für die Kühlung (ich glaube 1.5 l/min), 1200W Leistungsaufnahme (normaler 230V Anschluss), Kathoden (meine hat geschätzt nur 50 Stunden gehalten, sollte aber wohl auch länger halten können), Blenden habe ich bisher noch nicht getauscht, kommt aber früher oder später, kosten wohl ca. 80 Euro (Platin), der Szintillator hält auch nicht unbegrenzt, aber macht bisher keine Probleme. Alle heiligen Zeiten muss man wohl auch mal das Öl der Vorvakuumpumpe und der Öldiffusionspumpe wechseln, kann wohl auch einige 100 Euro kosten. Bisher komme ich billig weg...
Eine Wolframkathode kostet wie Eckhard schrieb ca. 35 Euro, ich habe zum Glück noch einige, die waren beim Gerät dabei. EM Zubehör bestelle ich bei der Fa. Plano, zu finden über Google unter "plano em". Da gibt es alles Erdenkliche, Kathoden, Blenden, Probenhalter, doppelseitig klebende und leitfähige Aufkleber zur Probenmontage etc.

@Jörg: danke für die Aufnahme in die Linkliste!

Viele Grüße an alle,
Christian

[the_playstation]

Hallo Christian

Wow. Wieder einmal sehr hochwertige, sehr gute REM Bilder. Zur Schärfe. Sehr wahrscheinlich der Arbeitsabstand. Aber manche Objekte sind auch schwerer "mit Elektronen zu beschießen", als andere.

Hallo Wilfried
Wir fahren die Kathode auch nicht maximal. Dadurch hält Sie recht lange. Wenn man sein REM selbst warten kann, sind die Kosten recht gering. Letzten Samstag war unser REM plötzlich sehr unscharf und matschig, da sich winzigste Partikel auf den Blenden befanden, ... Auch die Glühkathode muß 100% mittig sein, ... D.h. man muß selber putzen und justieren. Wobei "Putzen" es bei den Blenden nicht so ganz trifft.

Liebe Grüße Jorrit.

[Christian3000]

Hallo, Jorrit, und andere Interessierte,

ich bin nicht sicher warum die Schärfe doch recht nachlässt bei Vergrößerungen ab ca. 6000x. Ich kann 2 Basis-Arbeitsabstände einstellen, 34mm und 12mm. Diese kann man dann noch stufenlos variieren. Diesmal habe ich extra den kleineren gewählt, aber wie gesagt war die Unschärfe nicht anders als bei den 34mm. Daher nehme ich an, dass es noch einen anderen Grund geben muss. Aber Eckhard schreibt ja er arbeite mit wenigen mm, da muss ich noch experimentieren. Möglicherweise übeträgt sich auch die Vibration der Vorvakuumpumpe über den Fussboden, obwohl die sehr gut entkoppelt gelagert ist. Oder ich muss mal die Säule komplett zerlegen und säubern, vielleicht liegt es an einer der Blenden.
Die Kathode muss man recht fummelig unter dem Stereomikroskop justieren, der Feinabgleich erfolgt elektronisch über Tilt- und Shift-Einstellknöpfe.
Wie putzt Ihr Eure Blenden? Ich habe den Tip bekommen lieber gleich neue zu kaufen. Ich hoffe das dauert aber noch bis es notwendig wird. Es gab mal bei Plano ein Diamant-Reinigungsspray, das soll auch recht gut dafür sein. Auch für die Anode.

Ich habe vor, bei Gelegenheit 2 Threads hier anzufangen (kann aber nicht sagen wann ich dazu komme, das kann leider noch dauern. Ich möchte das auch gerne gut vorbereitet tun):
a) das REM mit Fotos mal vorstellen
b) die oben erwähnte vereinfachte Präparation mit soweit es geht ungefährlichen Chemikalien

Wer bei b) Lust hat mitzumachen, möge sich gerne schonmal einlesen oder sogar erste Versuche machen. Ich habe hier etliche Kilo Literatur, die ich noch durchsuchen werde. Ich stelle, wiederum sobald ich dazu komme, auch gerne eine Handvoll Bücher zum Thema vor.

Viele Grüße,
Christian

[wilfried48]

Hallo Eckhard, Jorrit und Christian,

vielen Dank für die Infos. Also zumindest beim Wolfram Kathoden Verbrauch dürften die Folgekosten noch im Rahmen bleiben.

Ich hatte die für teurer eingeschätzt, da wir in ganz früher Zeit (70-er, 80-er) die Wolfram Haarnadelkathoden noch im Institut selber hergestellt
und punktgeschweisst haben.

Die späteren REMs hatten alle mindestens LaB6 Einkristallkathoden oder W-ZrO Feldemissionsspitzen und die kosten zwischen 1000.- und 3000.- Euro und der Service den man zum Einsetzten braucht (wenn man nicht das Risiko der Spitzenzerstörung eingehen will) nochmal in etwa den gleichen Betrag dazu. Allerdings halten diese Kathoden dann auch bedeutend länger, wenn man sie nicht gerade durch Unvorsichtigkeit selber zerstört.

Das von mir erwähnte Philips XL 30 hat übrigens eine LaB6 Kathode, kann aber wohl einfach auf eine W- Kathode zurückgebaut werden, so dass eine Selbstwartung kostengünstig möglich ist.

Die Platinblenden haben wir früher übrigens zum Reinigen in einem Speziellen Platintiegelchen (gibt es bei Plano noch zu kaufen) in einer sauberen Bunsenbrennerflamme ausgeglüht.

In den moderenen REMs ist doch aber nur noch die Kondensorblende aus Platin (wegen der Temperaturblastung). Andererseits verschmutzt diese
gerade wegen der höheren Temperatur so gut wie nicht.
Die Aperturblenden im Objektiv sind Dünnschichtblenden, die naturgemäss weniger verschmutzungsanfällig sind und wenn man mehrere auf einem Halter hat auch leicht durch Verschieben gewechselt werden können.

Sorgen mache ich mir auch weniger wegen des notwendigen Vakuums, da bekommt man noch alle Ersatzteile auch gebraucht und das habe ich aus meiner physikalischen Vergangenheit auch voll drauf. Aber was passiert, wenn in der Elektronik etwas spezielles kaputtgeht ( wer hat schon die Schaltpläne, Ersatzteile und Kenntnisse) und falls es doch noch einen Service geben sollte ist der sicher nicht billig.

viele Grüsse
Wilfried

[Christian3000]

Hallo, Wilfried,

genau, solange es Wolfram-Kathoden sind ist es kein Problem. Lab6 werden schon unangenehm teuer, soviel ich weiß, und eine neue Feldemissions-Kathode liegt wohl bei 15000 EUR, habe ich gehört, ohne Gewähr. Allerdings weiß ich von Prof. Wanner (LMU München, Botanik, EM Abteilung), dass diese normalerweise nicht kaputt gehen, es also mehr Panik davor gibt als in der Realität angebracht. Aber im Institut laufen die Pumpen des Mikroskops ja auch immer durch, um stets ein einwandfreies Vakuum zu haben, das ist ja für FE Kathoden lebenswichtig.

Aha, das ist ein guter Tip von Dir, Wilfried: Die Halterungen der defekten Kathoden hebe ich also gut auf, denn wenn es eines Tages keine Kathoden mehr nachzukaufen gibt, kann man sich welche selbst herstellen. Wolfram-Draht kriegt man sicher, aber wie schweißt man den ? Übrigens habe ich gelesen, dass es einen Service gibt, der für einen genau das tut. Also noch ein Grund, die defekten Kathoden zu sammeln.

Hmmm, richtig günstig ist der Platintiegel aber nicht...wie auch. Zu Not kann man ja ein Schmuckkettchen mit den alten Blenden basteln, wenn schon nicht hübsch, wenigstens wertvoll ist es :-)

Leider kann ich bei meinem REM die Blenden nur durch Zerlegen wechseln, das ist etwas schade. Manchmal will man ja mehr Licht, manchmal mehr Auflösung, dazu wäre ein Wechsler schon gut.

Forsche doch mal im Institut, ob Du nicht die Schaltpläne/Servicemanuals findest, oder frag' im Vorfeld bei Philips nach, ob es die noch gibt. Bei mir waren 2 volle Ordner mit allen technischen Unterlagen und Schaltplänen dabei. Ich habe schon mehr Angst vor dem Vakuum als vor der Elektronik, vielleicht ergänzen wir uns da ja: Zusammen haben wir Angst vor beidem :-)

Einen Punkt gibt es noch: Vielleicht ist Euer Gerät aber auch neu genug, um dieses Problem nicht mehr zu haben: Zumidest die Philips REMs der 80er haben an verschiedenen Stellen (Strahlkopf (HV-Kaskade), HV-Netzteil für Monitore, evtl. auch Hochspannungsmodul für den Detektor) eine Silikon-Vergussmasse, die die Hochspannungsbauteile schützt und isoliert. Diese zersetzt sich nun, und es läuft sehr kriechfähiges und klebriges Silikonöl/-gallerte an mehreren Stellen heraus. Das gehört saniert, auch bei mir :-(  Die Silikonvergussmasse ist teuer und in Kleinmengen kaum zu bekommen (3-4 Liter). Wenn jemand einen Tip dafür hat, das wäre super.

Dazu fällt mir ein: Woher bekommt man hin und wieder kleine Mengen (10 Liter) flüssigen Stickstoff im Raum München? Ich würde gern mal die EDX ausprobieren...

Naja, da gibt es viel zu erzählen...

Viele Grüße,
Christian

[Eckhard]

Hallo Wilfried und Christian,

das Umrüsten von LaB6- auf Wolfram-Kathode sollte kein Problem sein. Die Elektronik ist i.d.R. sehr robust, eher würde ich befürchten, dass die Turbomolekularpumpe irgendwann ausfällt. Auch ist das Philips REM in der Prä-IC Zeit gebaut worde, Du solltest also Fehler in der Elektronik selbst reparieren können.

Dünnschichtblenden habe ich abgeschafft, ich bekomme mit den Kupferblenden ein besseres Bild. Ich hatte eine Scheibe mit Blenden 5, 10, 30, 60 und 120 mikron. Nun habe ich eine Kupferscheibe, mit 5, 10 und 4x30 mikron. Ich arbeite nur mit den 30 mikron Blenden. Damit komme ich auf 250.000x und habe immer noch anständig Strahlstrom.

Feldemitter kosten 3.000 bis 5.000€, halten aber viele Jahre.

Bekommst Du auch einen Sputter-Coater und einen CPD?

Flüssigen Stickstoff liefert Linde.

Herzliche Grüße
Eckhard