Einfache Autofluoreszenz mit Zeiss Standard Junior

[Rolf-Dieter Müller]

Wenn man mit der Forumssuchfunktion nach ,,Fluoreszenz" sucht, kommen immer wieder Hinweise, dass Autofluoreszenz durchaus mit einfachen Mitteln zu erreichen ist.

Und genau das geht sehr gut mit meiner neuen LED-Beleuchtung von Stephan Hiller für das Zeiss Standard Junior.

Um dieses zu zeigen habe ich als Objekt für Autofluoreszenz die Mittelrippe des Laubblattes von der Hänge Segge (Carex pendula) gewählt.

Zuerst brauchen wir eine Referenz, die ich mit Auflichtfluoreszenz und bekannten Filtersätzen am Zeiss Axiophot gemacht habe.

Da sollten wir nun in etwa erreichen:



links Zeiss Axiophot, 20x Plan-Apochromat, Auflicht-Autofluoreszenz mit Violettanregung 405 nm, Zeiss Filtersatz 05, F/0, 3.2 sec, ISO-100. Weißabgleich ,,auto"

rechts Zeiss Axiophot, 20x Plan-Apochromat, Auflicht-Autofluoreszenz mit Blauanregung 467 nm, Zeiss Filtersatz 09, F/0, 8 sec, ISO-100. Weißabgleich ,,auto"


Kommen wir jetzt zum Zeiss Standard Junior, alle Beispiel mit Durchlichtfluoreszenz. Anregungslicht von der Stephan Hiller'schen LED-Beleuchtung. Die Sperrfilter befinden sich im Strahlengang zwischen Objektiv und Okular. Praktischerweise habe ich da ein Optovar als Filterwechsler. Die Aufnahmen sind in Okularadaption mit der Nikon 1 J5 und Zoom-Objektiv mit 30 mm Brennweite gemacht worden.


Zur Orientierung zuerst eine Hellfeldaufnahme vom Querschnitt der Mittelrippe des Laubblattes von Hänge Segge (Carex pendula).


Hellfeld, weiße LED 5100 K, 1.2 Hellfeldkondensor, 10er Planapochromat, F/5.6, 1/4000 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,manuell"


Und wenn wir jetzt passende Anregungs- und Sperrfilter einfügen, erreichen wir Autofluoreszenz mit Blauanregung und zwar nur mit dieser weißen LED bei dem Beispiel.


Durchlicht-Autofluoreszenz, Anregungslicht weiße LED 5100K, BG3 als Anregungsfilter, 1.2 Hellfeldkondensor, 10er Planapochromat, Sperrfilter 530 nm, F/5.6, 1.3 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,Kunstlicht"


Wir können aber auch ganz auf den Anregungsfilter verzichten, wenn wir eine in der Lichtfarbe passende LED nehmen und das richtige Beleuchtungsverfahren wählen. Mit verschiedenen Sperrfiltern können wir die nachfolgende Autofluoreszenz erzielen.


Durchlicht-Autofluoreszenz, Anregungslicht LED violett 405 nm, Dunkelfeld mit Ultra-Kondensor, 10er Planapochromat, Sperrfilter 440 nm, F/5.6, 1.3 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,Kunstlicht"


Durchlicht-Autofluoreszenz, Anregungslicht LED violett 405 nm, Dunkelfeld mit Ultra-Kondensor, 10er Planapochromat, Sperrfilter 470 nm, F/5.6, 1.3 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,Kunstlicht"


Durchlicht-Autofluoreszenz, Anregungslicht LED violett 405 nm, Dunkelfeld mit Ultra-Kondensor, 10er Planapochromat, Sperrfilter 500 nm, F/5.6, 1.3 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,Kunstlicht"


Durchlicht-Autofluoreszenz, Anregungslicht LED violett 405 nm, Dunkelfeld mit Ultra-Kondensor, 10er Planapochromat, Sperrfilter 530 nm, F/5.6, 1.3 sec, ISO-160, Weißabgleich ,,Kunstlicht"


Und das alles mit dem kleinen Schwarzen.


Viele Grüße,
Rolf-Dieter Müller

[A. Büschlen]

Hallo Rolf-Dieter,

danke für diese interessante und lehrreiche Darstellung! Ich bin immer wieder beeindruckt, wie du zielgerichtet arbeitest.

Gruss Arnold Büschlen

[Carsten Wieczorrek]

Hallo Rolf-Dieter,

sehr schöne Bilder, ich muss mich auch mal wieder mit Fluoreszenz beschäftigen...

Grüße

Carsten

P.S. wolltest Du mir nicht Deine Adresse zukommen lassen, zwecks Zusendung...

[Fahrenheit]

Lieber Rolf-Dieter,

sehr schöne Aufnahmen von einem tollen Präparat! ich bin immer wieder erstaunt, wie vielfältig auch die autofluoreszenz in Szene gesetzt werden kann - ein wahres Farbenspiel.

Über einen kleinen Beitrag zum Thema für die MKB Webseite würde ich mich sehr freuen!

Herzliche Grüße
Jörg 

[Bob]

Hallo Rolf-Dieter, einen interessanten Vergleich hast Du da angestellt!
Für mich ergibt sich (für dieses Objekt) diese Schlussfolgerung:

- Durchlicht fluo mit Dunkelfeldk. ist besser als mit Hellfeldkondensor
- Durchlicht fluo mit Dunkelfeldkondensor muss nicht schlechter sein als Auflichtfluo

Das wird ja so nicht auf alle Objekte voll zutreffen. Bei dünnen Objekten eher als bei dickeren.

Weißt Du wie dick Dein Schnitt ist?


Viele Grüße,

Bob

[Rolf-Dieter Müller]

Liebe Mikrofreunde,

für Eure Kommentare möchte ich mich mit einer neuen Serie bedanken. Es ist ein Stämmchen-Querschnitt von Polytrichum formosum (Schönes Widertonmoos).


Zeiss Standard Junior 10x Planapochromat, LED-Beleuchtung von Stephan Hiller.

Links Durchlicht-Hellfeld. Mitte Durchlicht-Dunkelfeld mit 405 nm LED und 470 nm Sperrfilter. Rechts Durchlicht-Dunkelfeld mit 405 nm LED und 500 nm Sperrfilter.

Im Schnitt sind irgendwelche vagabundierende bzw. durch das Schneiden verschleppte Inhaltsstoffe, die ich so belassen habe, um nicht nach Reinigungsmaßnahmen die Autofluoreszenz zu beeinträchtigen.


@Arnold, natürlich habe ich die Bilder vom Moosquerschnitt speziell für Dich aufgenommen. Die klassische Auflicht-Autofluoreszenz mit Blauanregung ist bei Moosen etwas schwierig, denn bis auf das Chlorophyll äußerst schwach. Auflicht-Autofluoreszenz mit Violettanregung geht so einigermaßen.

Aber im Durchlicht-Dunkelfeld ohne Anregungsfilter (!) kann man schon einiges mehr erkennen, obwohl hier auch Strukturen ohne (oder ist schwacher(?)) Autofluoreszenz mit aufs Bild kommen. Es ist kein(!) Fremdlicht, die Aufnahmen habe ich in verdunkelter Umgebung gemacht.


@Carsten, ich habe Dir eine Email geschrieben, vielleicht sehen wir uns ja heute Abend oder im nächsten Monat beim MKB-Treffen.


@Jörg, natürlich machen wir auch etwas für die MKB-Webseite. Bei speziell anderen Objekten geht das noch eindrucksvoller. Ich mache dafür neue Schnitte.


@Bob, prinzipiell stimme ich Dir zu und Du hast vollkommen recht, die Schnittdicke ist wesentlich für ein ansehnliches Ergebnis. Je dünner umso besser. Ich schneide mit Haga Rasierklingenmikrotom so um die 30 µm. Eher einige µ dicker, weniger etwas dünner. Noch dünner geschnitten wäre das Ergebnis noch brillianter, wie es Gerhard Rawfoto mit seinem Pinus nigra- Schnitt gezeigt hat. Dünne Schnitte bringen nämlich auch bei Auftlichtfluoreszenz bessere Ergebnisse.

Die Autofluoreszenz mit Durchlicht-Dunkelfeld ohne Anregungsfilter(!) weicht schon um einiges von der klassischen Auflichtfluoreszenz mit den bekannten Filtersätzen und Durchlicht-Fluoreszenz mit abgestimmten Anregungs- und Sperrfiltern ab. Aber die Tendenz, die ist da.


Viele Grüße,
Rolf-Dieter

[wilfried48]

Hallo Rolf Dieter,

es ist immer wieder spannend zu sehen, zu was das kleine Junior mit einfachen Modifikationen fähig ist.
Welchen Ultrakondensor hast du benutzt und war der immergiert ?
Ich frage wegen einer Anwendung mit höheraperturigen Objektiven an kleinen fluoreszierenden Mikropartikeln.

viele Grüsse
Wilfried

[Rolf-Dieter Müller]

Hallo Wilfried,


der Dunkelfeldkondensor ,,Ultra-Kond" ist von Winkel-Zeiss, Göttingen, Nr. 132365. Immergiert habe ich einfach mit Wasser.

Noch zur Ergänzung, der Filterwechsler ist ein ,,Optovar" ist von Carl Zeiss, Germany, Nr. 4254725.


Manchmal sagen Bilder mehr, denn hierfür habe ich einmal das Mikroskop und die wesentlichen Teile fotografiert.




Links das komplette Zeiss Standard Junior für Durchlicht Dunkelfeld mit Violettanregung und Fotoeinrichtung.
Rechts oben die Beleuchtungseinheit von Stephan Hiller mit LED (vorne) und Steuergerät (hinten).
Rechts unten der Dunkelfeldkondensor ,,Ultra-Kond" (links) und Filterwechsler ,,Optovar" (rechts).


Im Übrigen kann ich die Beleuchtungseinheit mit LED auch für mein Zeiss Axio Unendlich-Mikroskop für Auflicht-Fluoreszenz statt einer HBO verwenden. Die erst beiden Bilder dieses Beitrags habe ich damit gemacht. Hierfür wird einfach die Einsteckleuchte gegen einen Adapter passend für die Axio-Schwalbe getauscht. Das habe ich aber schon hier gezeigt: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35237.msg259733#msg259733


Viele Grüße,
Rolf-Dieter

[Bob]

Hallo Rolf-Dieter,
danke für die detaillierte Beschreibung Deiner Ausrüstung. Ich glaube ein weiter ausgebautes Junior wurde hier noch nicht gezeigt!
An Deiner Nikon 1J5 verwendest Du ja das 10-30mm Zoom. Hast Du es mal mit dem 18,5er Normalobjektiv verglichen?
Wie löst Du die Kamera aus? Der 2 Sekunden-Timer setzt sich bei mir nach jeder Aufnahme zurück - hast Du Dich mal damit beschäftigt, das abzustellen?

Viele Grüße,

Bob

[wilfried48]

Hallo Rolf-Dieter,

vielen Dank !
Die Teile habe ich alle in meiner Sammlung.
Dann werden wir im Schülerforschungszentrum mal eines unserer schwarzen Junioren mit Dunkelfeld UV-Fluoreszenz ausrüsten
und schauen bis in welche Grössenordnung wir unsere fluoreszierenden Mikropartikel in Lösung sehen können.

viele Grüsse
Wilfried

[A. Büschlen]

Hallo Rolf-Dieter,

danke für den Vergleich mit dem Stämmchen-Querschnitt von P. formosum.

Gruss Arnold

[Rolf-Dieter Müller]

Liebe Mikrofreunde,

ich habe noch etwas.

Aber zuerst zu Bobs Fragen und hier meine Antworten:

1. Ich habe mich für das Zoom-Objektiv entschieden und fotografiere mit 30 mm Brennweite, weil ich am Mikroskop gerne Panoramaaufnahmen mache und nicht jedes Mal das Kameraobjektiv wechseln möchte.

2. Bei mir setzt sich der 2 Sekunden-Timer ebenfalls nach jeder Aufnahme zurück und wünschte mir auch eine Lösung dieses Problems. Andererseits gibt es eine Alternative. Die Kamera kann man ja mit einer Android-App steuern, nebenbei erhält ein Livebild aufs Handy oder Tablet.


Und jetzt, was ich noch habe. Das Zeiss Standard Junior kann Autofluoreszenz von Plankton.

Im März dieses Jahres hatte Gerd plaenerdd eine Planktonprobe zur Kornrade 2019 mitgebracht. Das Angebot, etwas mit nach Hause zu nehmen, konnte ich nicht ablehnen. In einem kleinen Glas gehältert, hat man somit immer noch einiges zum Mikroskopieren.

Um die Autofluoreszenz im Durchlicht-Dunkelfeld ohne Anregungsfilter, nur mit Sperrfilter zu demonstrieren, habe ich etwas Bodensatz pipettiert und komme zu nachstehenden Aufnahmen:

Alle Aufnahmen mit dem Zeiss Standard Junior, Planapo 10 / 0,32, LED Durchlichtbeleuchtung von Stephan Hiller.

Zuerst zur allgemeinen Orientierung eine Hellfeldaufnahme.



Planktonprobe mit Durchlicht-Hellfeld, Beleuchtung mit weißer LED.



Planktonprobe mit Durchlicht Dunkelfeld, Beleuchtung nur mit 405 nm-LED, Sperrfilter 440 nm.



Planktonprobe mit Durchlicht Dunkelfeld, Beleuchtung nur mit 405 nm-LED, Sperrfilter 470 nm.


Für das kleine Glas (ausgedientes Tintenfässchen) hat sich die Probe ja gut gehalten und mal sehen, wie ich sie für weitere Entnahmen über den Winter bekomme. Sie steht in einem nicht geheizten Zimmer ca. 1 m vom Nordfenster entfernt.


Viele Grüße,
Rolf-Dieter