Fixierung: PBS oder nur Phosphatpuffer

[Jürgen H.]

Liebe Kolleginnen und Kollegen, ein wohl eher theoretische Frage auf dem Gebiet der Histologie: Macht es irgendeinen Unterschied im Ergebnis, ob als Träger des Fixatives ein passendes PBS benutzt wird oder ein osmotisch ebenso passender schlichter Phosphatpuffer?

Auf die Frage stoße ich nach der Lektüre verschiedener Artikel auf dem Gebiet der Insektenhistologie. Mal wird die Fixierung mit PBS als Träger beschrieben, wobei meist nicht besonders erwähnt wird, wie sich die ,,phosphate buffered saline" zusammensetzt ( Auch dazu gibt es recht unterschiedliche Rezepte ). Mal wird schlicht Fixierung im Phosphatpuffer angegeben. Die Stoffmengenkonzentration des Trägers mag in beiden Fällen gleich sein, sie wird in beiden Fällen meist mit 0,1 oder 0,2 M angegeben.

Viele Grüße

Jürgen

[Ralf Feller]

Lieber Jürgen,
ich arbeite immer mit Phosphatpuffer (0,1 oder0,2M) und verwende auch immer nur
Formaldehyd ca. 5% und Glutaraldehyd ca.5%.
Die Osmose scheint mir dabei weniger wichtig weil Formaldehyd sehr schnell
penetriert, da sind die Membranen denn schon durchlässig.
PBS braucht man nur wenn man Organe in Flüssigkeit vor der Fixation präpariert.
Zuletzt habe ich aus Bequemlichkeit einfach Fertigpuffer nach Weise benutzt,
das ging auch.
https://de.vwr.com/store/product/17299656/null
(1 Tbl auf 100 ml Wasser statt auf 1L wie für die Hämatologie)
LG Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf, Danke für Deine Einschätzung. Du gehst ja scharf ( hochprozentig) ran, entsprechend dem ursprünglichen Karnovsky Rezept.:-)

Osmotische Effekte erwarte ich auch nicht, nach meiner Fragestellung sollte ja auch die Stoffmengenkonzentration keine Rolle spielen. Es geht nur darum, ob der Träger des Fixans dem Salzgehalt der Hämolymphe z.B bezüglich der Na und Ka Ionen etc angepasst sein sollte, oder ob ein Puffer reicht. Eine zugegebenermaßen für die Lichtmikroskopie wohl eher theoretische Frage. Ich gehe auch davon aus, dass selbst fürs TEM genommen wird, was gerade zur Hand ist.

Viele Grüße

Jürgen

[Rene]

ob ein Puffer reicht.

Ein Puffer reicht

Eine zugegebenermaßen für die Lichtmikroskopie wohl eher theoretische Frage.

Meiner Erfahrung nach ist es für  Aldehydfixation vor allem in zartem und/oder saurem Wasser wichtig ein Puffer zu gebrauchen.

Viele Grüße,
René

[MikroManni]

Hallo Jürgen,

deiner Aussage, dass man für TEM (TRansmissionselektronenmikroskopie am Ultradünnschnitt) den Puffer nimmt, der gerade vorhanden ist, möchte ich widersprechen.
Habe selbst 30 Jahre Bakterien, eukaryontische Zellen, Organoide etc eingebettet. Der Puffer der Wahl zu Beginn war der in der Medizin (Pathologie) gebräuchliche Cacodylat-Puffer, ein Barbiturat Puffer. Wurde dann verboten zu benutzen, da die Chemikalie nicht im Labor gelagert werden durfte und man keinen Nachschub mehr bekam. Man ist dann auf verschiedene PBS Puffer gewechselt, die aber immer NaCl enthielten. Reine Phosphatpuffer wurden nicht häufig benutzt. Danach hat man sich mehr an den HEPES (chemisch: 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid) Puffern orientiert, die heute recht häufig benutzt werden.

Die Verwendung der Aldheyde ist sehr von der Fragestellung abhängig. Die verwendeten Prozente 5% Formaldehyd und 5% Glutaraldehyd sind für eukaryontische Zellen und Bakterien viel zu hoch, z.B. sehen Mitochondrien nach diesen hohen Konzentration "sehr mitgenommen" aus. Hinsichtlich Formaldehyd ist zu beachten, wenn man das 37% Formaldheyd aus der z.B. Merck/Sigma/Aldrich Flasche nimmt, hat man ebenfalls bis zu 10% Methanol, das zur Stabilisierung der Lösung dient, damit diese nicht aufpolymerisiert, in der Lösung. Methanol kann Proteine fällen. Wir haben immer Formaldehyd aus Paraformaldehyd, einem Pulver, hergestellt.

Für eine "gute" Fixierung für TEM haben wir oft eine Vorfixierung mit 1% Formaldehyd vorgenommen, mit HEPES gewaschen und dann 1% Glutaraldehyd oder eine noch niedrigere Konzentration. Sollte noch ergänzen, dass zusätzlich mit Osmiumtetroxid nachfixiert wurde.
All diese Überlegungen haben keine große Relevanz für die normale Lichtmikroskopie, solange man keine plasmolytischen Effekte in den Zellen findet. Anders sieht dies schon für Konfokale Mikroskopie aus.

Beste Grüße
Manfred

[purkinje]

Hallo,
fürs Hauslabor sind Feststoffmischungen für Phosphatpuffer (wie die erwähnten Tabletten) super, wenn in kleinen Mengen dosierbar, da Stammlösungen v.a. wenn nicht sterilisert werden kann, gern besiedelt werden und umkippen können.
Kurze Ergänzung zu Dimethylarsinsäure (Cacodylate-Buffer), gibt zB. es in der Molekularbiologie in dann kleinen Mengen immer noch; ist sicher nichts für den Hausgebrauch und ist der Grund warum bis heute in Vietnam nur geschälter Reis gegessen wird, da die Vereinigten Staaten damit die Reisernten im Vietnamkrieg vernichtet haben (Agent Blue).
Beste Grüße Stefan

[Jürgen H.]

Mein Beitrag ist veranlasst durch die Lektüre von verschiedenen Artikeln zu den Malpighischen Gefäßen der Insekten. Es fallen mir die Unterschiede bei der Fixierung ins Auge. Die in gepuffertem Ringer entommenen Gefäße werden z.B wie folgt fixiert:

1. 4% GA in 0,1 M PB Nachfixiert in Osmiumtetroxid
2. 2,5% GA in 0,2 M PB Nachfixiert in Osmiumtetroxid
3. 2,5 % GA in 0,05 M PB + 3% Succrose
4. 2,5 % GA + 2% FA in 0,1 M PBS

GA= Glutaraldehyd, PB = Phosphatpuffer, FA = Formaldehyd, PBS phosphatgepufferte Salzlösung.

Die Fragestellung in den Artikeln betraf im Grunde immer die Feinstruktur der Gefäße.

Meine Vorstellung ist, dass die Sektion zwar immer in PBS, im Salzgehalt möglichst angenähert der Hämolymphe stattfinden muss. Bei der Fixierung spielt hingegen die Zusammensetzung der Hämolymphe keine Rolle mehr, w e n n nur die Stoffmengenkonzentration von Hämolymphe und Fixativ übereinstimmt.

Malpighische Gefäße enthalten z.B. verschiedene Caniculi, die von der basalen Membran ins Zellinnere verlaufen und diverse Vakuolen, Organe, für die allerdings die Stoffmengenkonzentration sicher eine Rolle spielt.

Viele Grüße

Jürgen

[purkinje]

Hallo Jürgen,
meine Erfahrungen mit genau derartigen Fixativen beruhen auf Erfahrungen mit Nervenbiopsien, dort gibt es auch genau diese Varianten mit/ohne Osmiumtetroxid, Sucrose entweder FA und oder GA. Diese beruhen oft auf tradierten Laborerfahrungen (never change a running system) und der nachfolgenden Präparation und Untersuchung: zB Osmiumtetroxid bei EM, Sucrose bei Kryoschnitten als "Frostschutz", GA-Fixative  können bestimmte Molekularbiologischen und immunologische Untersuchungen stören, andere Antikörper funktionieren nur gut bei GA- fixiertem Gewebe etc.
Daher die Frage wie möchtest Du untersuchen?
Mein Bauchgefühl würde fürs erste bei reiner nativer Morphologie zu entweder GA oder FA Fixativ (gepuffert) ohne weitere Zusätze im Vergleich tendieren. Und ich neige zu PBS.
Beste Grüße Stefan

[Jürgen H.]

Lieber Stefan, mir geht es nur um die Morphologie der Innereien von Insekten. Zuletzt habe ich dafür 2,5 % GA in 0,1 M PBS verwendet, in gleicher PBS gespült und in Alkoholstufen entwässert. Für ganze Tagmata anders: Davidson (FAE Gemisch) oder alk. Bouin.

Danke für Deine Hinweise

Jürgen