Anwendungen der Fluoreszenz-Mikroskopie

Holger Adelmann · Januar 27, 2012, 10:22:42 VORMITTAG

Liebe Kollegen,

ich sehe im Forum mehr und mehr Fluoreszenzaufnahmen, was mich sehr freut.
Man kommt durch die Verfügbarkeit von genügend energiereichen LEDs ja heute zunehmens auch ohne die teuren Entladungslampen aus, damit wird das schöne Verfahren auch für viele erschwinglich.

Die folgenden Beispiele gehen querbeet durch die "Landschaft" und mögen dem einen oder anderen im Forum als Anregung für eigene Experimente dienen.
Für Fragen, z.B. zu den verwendeten Filtern stehe ich gern zur Verfügung.

Viel Spass & herzliche Grüsse
Holger

Alle Fotos mit Leitz Orthoplan, Auflicht Fluoreszenz, Lampe HBO 50 W, weitere Angaben zu den Bildern.

Chromosom aus der Speicheldrüse der Zuckmückenlarve, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung

Das gleiche Präparat, nur im Phaco, Auflicht-Strahlengang blockiert

Die folgenden 2 Bilder zeigen Meiosestadien aus dem Hoden der Heuschrecke, Essigsäure-Quetschpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung

Die folgenden 2 Bilder zeigen Meiosestadien aus dem Hoden der Heuschrecke, Essigsäure-Quetschpräparat, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung

Die folgenden 2 Bilder zeigen eingedeckte, gefärbte Pflanzenschnitte, UV-Anregung (erstes Bild), Blau-Anregung (zweites Bild)

Die folgenden 3 Bilder zeigen eingedeckte, gefärbte Pflanzenschnitte von Robin Wacker, UV-Anregung (erstes und drittes Bild), Blau-Anregung (zweites Bild)

Die folgenden 2 Bilder zeigen Amöben im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung

Das folgende Bild zeigt eine Kieselalge mit aufsitzenden Bakterien im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung

Die folgenden 3 Bilder zeigen Pilzhypen im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung

Die folgenden 3 Bilder zeigen Ciliaten im Lebendpräparat, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz.
Farbstoffe: DAPI (Bilder 1 und 2), Acridinorange (Bild 3), UV-Anredung (Bilder 1 und 2), Blau-Anregung (Bild 3)

Zwei Individuen von Stephanosphaera pluvialis Cohn, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls, Blau-Anregung

Die folgenden 2 Bilder zeigen Glockentierchen im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung

Die folgenden beiden Bilder zeigen Bindegewebszellen der Maus in der Zellkultur, Durchlicht DIC mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung.
Wie man sieht kann man auch den differentiellen Interferenzkontrast mit Auflicht-Fluoreszenz kombinieren und erhält schöne Bilder.
Allerdings sollte man die Strahlenbelastung der empfindlichen Wollastonprismen im Objektiv möglichst gering halten

bewie · Januar 27, 2012, 11:04:13 VORMITTAG

Hallo Holger,

vielen Dank für diese phantastische Bilderserie, wirklich sehr eindrucksvoll!

Mich interessieren die emissionsseitigen Filter. Die scheinen - wenn die Beleuchtung simultan war - ja wesenlich breitbandiger gewesen zu sein, als das beispielsweise bei vielen derzeitigen Filterkombinationen von Zeiss der Fall ist. Da werden heutzutage oft sehr schmalbandige Filter eingesetzt, offenbar um hohe Trennschärfen zu erzielen, das Durchlicht kommt da nie so durch wie bei Deinen Bildern. Hast Du statt dessen Tiefpassfilter verwendet?

Schöne Grüße
Bernd

Holger Adelmann · Januar 27, 2012, 11:38:51 VORMITTAG

Danke für die Blumen, Bernd

Zu den Filtern habe ich Dir ein paar Transmissionskurven und Daten angehängt.

Herzliche Grüsse
Holger

Es bedeuten: BP = Bandpass-Filter, RKP = Reflektionskurzpass-Filter, LP = Langpass-Filter

UV
Leitz Filterblock A
Anregungsfilter: BP 340-380
DichroitischerTeilerspiegel: RKP 400
Sperrfilter LP 430

Blau
Leitz Filterblock H3
Anregungsfilter: BP 420-490
DichroitischerTeilerspiegel: RKP 510
Sperrfilter LP 515

bewie · Januar 27, 2012, 13:26:41 NACHMITTAGS

Hallo Holger,

vielen Dank, damit ist alles klar! Insbesondere bei DAPI bleibt hier natürlich noch viel vom Durchlichtspektrum übrig.

Und entschuldige, dass ich Tiefpass geschrieben habe - natürlich heißt es in der Optik Langpass, auch wenn es beidesmal um die längeren Wellen geht ...

Herzliche Grüße
Bernd

Frank D. · Januar 27, 2012, 19:54:40 NACHMITTAGS

Hallo Holger,

ich bin wirklich beeindruckt!
Je weiter ich nach unten scrolle, desto stärker leuchten nicht nur Deine Bilder.

Kannst Du mir bitte kurz den Färbevorgang mit Acridinorange an den Lebendpräparaten erklären?
Das würde mich interessieren.

Danke für die Fotos!

Herzliche Grüße
Frank

Ronald Schulte · Januar 27, 2012, 20:45:51 NACHMITTAGS

Holger,

An meinen Orthoplan habe ich keine Fluoreszenz aber wie ich deine Bilder beobachte muss das auch noch mal dran.

Die Chromosomen mag ich am meisten, klasse!

Grüße Ronald

peter-h · Januar 27, 2012, 23:18:03 NACHMITTAGS

Hallo Holger,

sehr schöne Bilder ! Eine Frage dazu : Wie lange leben Deine Tierchen bei der Acridinorangefärbung? Mit der UV-LED @ 365nm waren die schneller im Jenseits, als ich Aufnahmen machen konnte.

Schönes Wochenende und Grüße
Peter

Klaus Herrmann · Januar 27, 2012, 23:57:11 NACHMITTAGS

Wunderbare Bilder lieber Holger und eine schöne Anregung!

Acridiorange kann ich kleinster Verdünnung 1:10.000 und kleiner schöne Vitalfärbungen machen.
Vor 2 jahren hatten wir auf Wohldenberg Fluoreszenzaufnahmen von Zieralgen gemacht, die mit AO angefärbt wurden. Auf die Schnelle habe ich dieses Bild in meinem PB-Album gefunden

Holger Adelmann · Januar 28, 2012, 01:21:26 VORMITTAG

Nochmals allen Danke für das nette Feedback

@ Bernd: Der Tiefpass der Elektrotechnik entspricht dem Langpass in der Optik - ist völlig korrekt

@ Frank und Klaus: Ich nehme auch eine Primärverdünnung von 1:10.000, tauche dann die Spitze einer Präpariernadel kurz darin ein und verrühre nur die winzige Menge, die an der Spitze haftet (!) mit dem Wassertropfen und den darin befindlichen Organismen auf dem Objektträger. Dann warte ich etwa 2 Minuten bevor ich das Deckglas auflege. Das führt zu einer schöneren und gleichmässigeren Anfärbung der Organismen. Ausserdem bleibt der Hintergrund dann schön schwarz und bietet so einen schönen Kontrast. Ich habe immer festgestellt dass hier weniger mehr ist.

@ Peter: In der Tat, während die Tierchen das Acridinorange und die Blaulichtanregung bis zu 30 Minuten tolerieren, gehen sie bei DAPI / UV Anregung in der Regel nach etwa 1 Minute kaputt.

@ Ronald: Ja, die Fluoreszenzmikroskkopie lohnt sich auch für die Histologie, man kann auch die Schnitte markieren. Die Quetschpräparate zeigen aber - man muss ja nicht alles schneiden

Schöne Restnacht noch

Holger

Frank · Januar 28, 2012, 07:57:16 VORMITTAG

Hallo Holger,
könntest Du mir noch etwas zu der DAPI-Lösung sagen. Erzeugst Du hier erst eine Stammlösung und welches Mischungsverhältnis verwendest Du?
Und wie ist dann der Färbevorgang?

Viele Grüße
Frank

Holger Adelmann · Januar 28, 2012, 10:03:41 VORMITTAG

Hallo Frank (2), gerne:

DAPI kaufe ich in kleinen Mengen, es ist teuer aber sehr ergiebig. Ich löse 1 mg in 1 ml dest Wasser und fülle das dann 50 µl-weise in kleine Crimp-Flaschen (siehe Bild) ab, die ich dann sofort einfriere (das Rack mit den Fläschchen umwickele ich zum Lichtschutz noch mit Alufolie). Ich habe festgestellt, dass diese Stammlösung jahrelang hält.

Die Färbung von fixierten Zellen (in meinem Beispiel Heuschreckenhoden oder Maus-Fibroblasten) geschieht dann in einer mit Methanol aufgefüllten DAPI Stammlösung mit einer Endkonzentration von 1µg / ml (also 1000-fache Verdünnung der Stammlösung). Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop geschieht entweder (als Wegwerfpräparat) nach Einschluss des wieder lufttrockenen Ausstriches unter einem Deckglas in reinem Glycerin oder als Dauerpräparat nach Einschluss des wieder lufttrockenen Ausstriches in DPX, einem fluoreszenzfreien Einschlussmittel. Ich war erstaunt, wie gut meine ersten, in den 90er Jahren gefertigten Dauerpräparate heute noch fluoreszieren.

Als Lebendfarbstoff gehe ich genau so vor wie mit Acridinorange in meinem vorigen Beitrag beschrieben. Ich tauche die Spitze einer Präpariernadel in die DAPI Stammlösung und übertrage nur winzige daran klebende Tröpfchen in die Frischprobe auf dem Objektträger und warte - hier ca 5 min. Man sollte immer bei etwas reduzierter Beleuchtung arbeiten.

Originalarbeit:
Tanious FA, Veal JM, Buczak H, Ratmeyer LS, Wilson WD. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA:
minorgroove binding at AT sites and intercalation at AU sites. Biochemistry 31 (1992) 3103-3112

Info zur Verwendung von DAPI:
http://www.applichem.com/fileadmin/produktinfo/a1001_de.pdf

Bleibt noch die Warnung, sauber und mit Handschuhen zu arbeiten. Die Substanzen keinesfalls einatmen oder verschlucken. Auch soll die Entsorgung professionell geschehen. Alle Fluoreszenzfarbstoffe, besonders aber die mit starker Bindung an die DNA (z.B. DAPI oder Ethidiumbromid) sind potentiell mutagen und karzinogen!

Herzliche Grüsse
Holger

Stefan_O · Januar 28, 2012, 15:14:19 NACHMITTAGS

Hallo Holger,

sehr interessant! Hast Du den Filterblock A (oder besser A2) mal mit ein paar Dünnschliffen getestet? Würde mich sehr interessieren.

Gruss,
Stefan

Holger Adelmann · Januar 28, 2012, 16:14:23 NACHMITTAGS

Gute Idee Stefan, ich werde beide Blöcke mal testen. Ich weis allerdings nicht ob der Kleber nicht fürchterlich fluoresziert, aber probieren geht über ...

Viele Grüsse
Holger

Frank · Januar 28, 2012, 17:00:46 NACHMITTAGS

Hallo Holger,
ich habe noch eine kleine Menge DAPI und lagere sie trocken im Kühlschrank (schon ca. 2 Jahre).
Denkst du das ist noch zu gebrauchen bzw. würdest Du dazu raten eine Stammlösung zu erzeugen und diese einzufrieren?

Gruss
Frank

Stefan_O · Januar 28, 2012, 17:04:46 NACHMITTAGS

Hallo Holger,

vielen Dank, ich bin gespannt. Calcit sollte ein guter Start sein, oder Material aus Sterling Hill, falls Du welches hast. A2 ist die bessere Wahl, je kürzer die Wellenlänge, desto besser. Mir schwebt das schon sein einiger Zeit im Kopf, ich bin aber dank des Kampfes mit und gegen das Spektropmeter noch nicht dazu gekommen, abgesehen davon, das der A2 nicht gerade häufig ist.

Gruss,
Stefan