IMMUNHISTOCHEMIE: C Zellen der Schilddrüse

[Ronald Schulte]

Ich habe ein frage zum Nachweis von C Zellen;

Die C Zellen in der Schilddrüse Bilden das Polypeptidhormon Calcitonin. Im HE Präparat sind die Zellen kaum erkennbar.

- Im Bild habe ich fünf Pfeilpunkte eingezeichnet: könnten das die C Zellen sein? (Die Drüse ist von eine Ratte)
- Die C Zellen kann man Immunhistochemisch Nachweisen: wie geht so eine Färbung vor?
- Kann man so ein Nachweis auch zu Hause ausführen oder wird das zu aufwendig, teuer usw?
- Wer könnte mich dann die Farbstoffe liefern?

Hoffe das eine günstige Antwort kommt, Grüße Ronald 

[purkinje]

Hallo Ronald:
Calcitonin wird beim  gesunden Menschen nur in winzigen Mengen produziert, daher ist die Immunhistochemie (IHC) mit Antikörpern gegen Calcitonin nur bei bestimmten Tumoren- auch Schilddrüsentumoren sinnvoll -aber vieleicht kann dir einer der Pathologen hier im Forum besser weiterhelfen.
IHC ist teuer (teils sehr teuer) und auch aufwendig weshalb selbst in der Forschung oder Routine oft Validitätsprobleme bei Nicht-Routine-Antikörpern auftreten.
An den 1. Antikörper muss ja dann in einem 2 Schritt ein 2. Antikörper angekoppelt werden, welcher entweder mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem Enzym zu einer klassischen Farbstoffbildung gekoppelt sein muss. Je nach Gewebe gibt es teils erhebliche unspezifische Reaktionen (falsch positive Resultate).

Bester Gruß
Stefan

[Ronald Schulte]

Stefan,

Danke für deine ausführliche Antwort. Ich denke das ich mein Geld dann besser in andere Histo Sachen stecken kann.

Grüße Ronald

[Florian Stellmacher]

Lieber Ronald,

wir hatten ja bereits darüber diskutiert und auch schon einige immunhistochemische Färbungen gemeinsam unter dem Mikroskop angesehen. Damit jeder versteht, worauf Deine Frage abzielt, erlaube ich mir etwas weiter auszuholen.

Wir unterscheiden in der Histologie im Wesentlichen drei Arten von Färbungen:

1.   Die elektrostatische Färbung, bei der es zur Anlagerung von Farbstoff an biologische Strukturen aufgrund von elektrostatischen Anziehungskräften kommt. Ein typisches Beispiel wäre hier z.B. die Hämatoxylin-Eosin-Färbung; Hämatoxylin hat hierbei eine höhere Affinität zu (allgemein gesprochen) Strukturen im Zellkern, Eosin eher zu Strukturen im Zytoplasma.

2.   Die histochemische Färbung. Hierbei entsteht der lichtmikroskopisch erkennbare Farbstoff durch eine chemische Reaktion mit bestimmten im Gewebe vorhandenen Stoffen wie z.B. sauren Mucopolysacchariden, die in der PAS-Färbung nachweisbar sind, oder Eisen, das in der Berlinerblau-Reaktion klar hervortritt.

3.   Die immunhistochemische Färbung, die Gegenstand Deiner Frage ist.

Einfach gesprochen basiert diese Färbung auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion (eigentlich heute sogar zwei), bei der der Farbstoff (zumindest in der Theorie) ganz spezifisch bestimmte Strukturen im Gewebe ,,erkennt" und mit diesen wie Schlüssel und Schloss eine feste Verbindung eingehet. Hierbei kommen diagnostische Antikörper zu Anwendung. Antikörper sind eigentlich elementare Bestandteile des Immunsystems, die von B-Lymphozyten als Reaktion auf in den Körper eingedrungene Fremdstoffe gebildet werden. Sie sind so aufgebaut, dass sie diese Fremdstoffe (Makromoleküle) spezifisch erkennen und an ihnen – und nur an ihnen – binden. Diagnostische Antikörper richten sich gegen bestimmte Strukturen z.B. auf der Zelloberfläche (Membran-/Transmembranproteine wie Thyrosinkinasen, die als Rezeptoren (z.B. HER2/neu) fungieren), im Zytoplasma (z.B. die zahlreichen Zytokeratine) oder im Zellkern (z.B. der Östrogen- und der Progesteronrezeptor, TTF-1 oder zahlreiche weitere Proteine) liegen.

Solche diagnostischen Antikörper wurden zunächst direkt mit Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt. Dies konnte zwar auch geringe Farbstoffmengen (z.B. bei eher schwacher Affinität des Antikörpers zum Antigen) detektieren, erforderte jedoch eine entsprechende apparative Voraussetzung inkl. eines Büros, das sich abdunkeln lässt. Daher ist die Immunfluoreszenz heute nur noch bestimmten Fragestellungen und z.T. modifiziert (mit Sekundärantikörper) üblich (z.B. spezifischer Erregernachweis für Lamblien, Cryprococcus oder Treponemen (z.T. mit AK-Titer-Bestimmung – so etwas macht die Mikrobiologie und nicht die Pathologie) oder z.B. Antikörpernachweis in der Basalmembran).
Später wurde die Technik so verfeinert, dass die qualitativ verbesserten Antikörper direkt mit einem Farbstoff gekoppelt wurden, der im Durchlichtmikroskop auch bei schwacher Auflösung gut erkennbar ist.
Heute verwendet man eine Vielzahl der unterschiedlichsten Primärantikörper, die gegen bestimmte Antigene des Gewebes gerichtet sind, die jedoch an der dem Antigen gegenüberliegenden Stelle eine Domäne aufweisen, die wiederum für einen Sekundärantikörper erkennbar ist. Erst der Sekundärantikörper trägt dann den sichtbaren Farbstoff. Die Bindung des Sekundär- an den Primärantikörper läuft dabei recht simpel ab, wobei je nach verwendetem Detektionssystem auch zahlreiche Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden können, wodurch das Signal verstärkt wird. Weit verbreitet ist heute z.B. die Labeled Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode (LSBC). Als Farbstoffe haben sich Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) (braun) und 3-Amino-9-Ethylcarbazol (rot) durchgesetzt.

Die Immunhistochemie ist heute ein aus der modernen Pathologie nicht mehr wegzudenkendes Verfahren. Einerseits lässt sich durch die Positivität gegen bestimmte Antikörper der subjektive morphologische Eindruck objektivieren, andererseits kann die Immunhistochemie erst die entscheidenden Hinweise für die Diagnose erbringen. Hier ist in erster Linie natürlich an die Tumordiagnostik zu denken, bei der die Aufklärung der exakten Tumorentität in Bezug auf Therapie und Prognose essentiell ist. Zur Identifikation einer bestimmten Tumorentität reicht jedoch die Positivität gegen einen einzigen Antikörper nicht aus, sondern man färbt ein sinnvoll ausgewähltes Panel, berücksichtig jedoch immer auch die Morphologie. Man muss sich vielleicht vor Augen führen, dass ein entdifferenzierter epithelialer Tumor (Karzinom) einem entdifferenzierten mesenchymalen Tumor (z.B. Sarkom) oder einem anaplastischen Lymphom recht ähnlich sehen kann, wobei der sog. Immunphänotyp – also die vom Tumor exprimierten Marker – (hoffentlich) unterschiedlich sind. Die Immunhistochemie erlaubt auch darüber Aufschlüsse, ob ein bestimmtes Medikament bei einem Patienten überhaupt wirken kann, indem das Protein, gegen das das Medikament gerichtet ist, zunächst im Schnittpräparat nachgewiesen wird. Ist es nicht vorhanden bzw. nicht in definierter Mindestmenge vorhanden, wirkt die Therapie nicht.

Technisch werden immunhistochemische Färbungen heute in großem Maßstab durch Färbeautomaten durchgeführt, die zig Färbungen pro Apparat simultan ausführen können. Hunderte wenn nicht tausende von Doktoranden können jedoch bezeugen, dass man immunhistochemische Färbungen auch ,,zu Fuß" durchführen kann. Dabei gibt es neben der eigentlichen Färbung eine Reihe zusätzlicher Arbeitsschritte. Man mache sich z.B. klar, in welchem Zustand sich größere Proteine z.B. an der Zellmembran befinden, nachdem das Gewebe abgestorben ist und nach der Fixierung Alkoholstufen, Xylol, heißes Paraffin, wieder Xylol und Alkoholstufen durchlaufen hat – diese Moleküle wieder ,,auszuklappen" erfordert einiges an Know How. Man wundert sich bisweilen, welche Geräte aus der gehobenen Küche auch im histologischen Labor zu finden sind.

Diagnostische Antikörper werden von diversen Firmen vertrieben. Man erhält kleinste Mengen i.d.R. in einem Preisrahmen zwischen 250 und 500 € (es geht auch teurer), die dann zumeist weiter verdünnt werden. Allein der Nachweis eines einzigen Antigens im histologischen Schnitt erreicht somit spielend den Preis einen ordentlichen gebrauchten Objektivs, erst wenn man einen Antikörper häufig braucht, kann man die Immunhistochemie auch für den Hausgebrauch empfehlen, ansonsten ist das ein sehr teurer Spaß!

Bei Bedarf kann ich auch mal ein paar Beispiele zeigen, wie die Imunhistochemie dem Pathologen bei der Arbeit wertvolle Dienste leistet.

Herzliche Grüße,
Florian

[Heino Lauer]

Lieber Florian,

vielen Dank für Deine Erläuterungen, die mir sehr wertvoll sind. Über Beispiele würde - sicher nicht nur ich -  mich sehr freuen.

Herzlicher Gruß

Heino

[JB]

Hallo Ronald,

Wie Florian schon ausgefuehrt hat sind die Anschaffungskosten fuer Immunohistochemie recht hoch (hunderte Euro), plus den Kosten fuer die Ausarbeitung eines Arbeitsprotokols.

Die eigentlichen Materialkosten sind ueberschaubar. Die Materialkosten liegen zwischen 10 Cent und 5 Euro (nicht-diagnostisch); hier ist eine realistische Kostenaufstellung: http://www.icms.qmul.ac.uk/corefacilities/pathology/price%20list.htm

Wirklich lohnen tut sich das aber wegen der hohen Einstiegskosten (je exotischer das Antigen desto hoeher die Kosten) aber erst wenn man eine klare Fragestellung loesen moechte und wenn man jemanden (zB an einer Uni) findet der einen dabei unterstuetzt.

Beste Gruesse,

Jon

[Ronald Schulte]

@Jon,

Danke für deine Erweiterungen.


@Florian,

Danke für dein ausführliche Erläuterung. Natürlich hast du mir schon einiges gezeigt und kann mich noch gut das schöne Fishpräparat im Fluoreszenz erinnern.
Ich dachte/hoffte das das Calcitonin ein im Gewebe vorhandenden Stoff war und sich so vielleicht mit ein Histochemische Färbung sichtbar machen ließ. Leider ist das also nicht so.
Einige aufnahmen die in die Pathologie gemacht werden wurde ich, und mehrere denke ich, sehr gerne sehen. Braucht nicht unbedingt jetzt, weil du denke ich auch noch mehrere Sachen zu erledigen hast, aber zukünftig mal in vielleicht ein neuen Beitrag oder so.

Grüße aus den Nordfjord, Ronald