Frage zur Isomethode nach Klaus Henkel

Begonnen von Nora, Januar 13, 2015, 09:15:11 VORMITTAG

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Nora

Guten Morgen zusammen,

ich hab wieder eine super Frage... 8)
Ich bin nun endlich mal beim Paraffineinbetten angekommen, und wollte die Isomethode von Klaus Henkel ausprobieren. Nun stellt sich mir beim Schritt vom Iso ins Paraffin die Frage: das mischt sich ja überhaupt gar nicht??? Iso4 mit Probe als auch Paraplast (Schmelzpunkt 56°) waren eine Stunde bei 62° im Wärmeschrank, es relativ wenig weil ich nur ein kleines Stückchen Material habe, es sollte also alles schön gleich warm gewesen sein. K.H geht wenn ich richtig verstanden haben von 45°Iso ins 63° heiße Paraffin, aber da sollte es sich aber dann noch schlechter mischen?
Auf jeden Fall, gestern das heiße Iso ins heiße Paraffin gekippt, kräftig umgeschwenkt, wird schön trüb, Probe dazu, schwimmt plötzlich oben (war im Iso noch unten), weiter schwenken, PRobe irgendwann unten, zurück in Wärmeschrank, und mangels schlechter Zeitplanung (bzw wußte ich nicht daß Paraffin sooooooo lang braucht bis es schmilzt...) erstmal nach Hause, heißt das Zeug stand da nun über nacht. und heut früh mach ich den SChrank auf, habe zwei fein säuberliche Phasen, und mein GEwebe schwimmt ganz oben im Isoprop... :-\ Das kann ja wohl irgendwie nicht stimmen. Oder doch?!?!?
Ich mein, ich hab hier genug Rotihistol, bzw wenn ich suche finde ich vermutlich sogar irgendwo "richtiges" Xylol, um den "klassischen" Weg zu probieren, aber da in diversen QUellen wie zB auch im Romeis steht, daß es mit Isopropanol alleine auch klappen soll, frage ich mich eben, ob das vielleicht so muß wie es ist?
Für Tips und Erhellung dankbar!  :)

Nora

treinisch

#1
Hallo,

vorweg: du könntest Dir für meinen Geschmack etwas mehr Mühe bei der Formulierung des Beitrages geben, den Text muss man schon drei mal lesen, bis sich der Sinn erschließt. Das ist nicht böse, meckrig oder besserwisserisch gemeint, ehrlich.


Du schreibst gar nicht, was für Isopropanol du verwendest. Wie alt, woher, welche Qualität und vor allem: Wie viel Wasser ist drin? Eigentlich löst sich meiner Erfahrung nach Paraffin recht gut in heißem Isopropanol, wobei meine Erfahrung chemischer und nicht histologischer Natur ist. Es muss aber schon recht trocken sein.

vlg
Timm
Gerne per Du!

Meine Vorstellung.

Nora

Danke für die Antwort!
Ich gebe zu, ich hab den Beitrag etwas eilig geschrieben, weil ichs noch vor dem nächsten Termin loswerden wollte, und für mich die ich grad mitten in der Materie drinstecke ist natürlich alles völlig klar... 8)
Ich habe jetzt heut früh die Mischung (20 + 20ml) nochmal bis zur Trübe umgeschwenkt (ich habs in so einer Blaudeckellaborflasche http://www.ehlert-partner.de/BILDER/LABFLasch.jpeg ), und so schaut es jetzt immernoch aus, also trüb, und das Gewebe ist wieder unten. Ist das jetzt richtig so? Vielleicht war es gestern dann doch einfach noch nicht gleichmäßig temperiert??
Mein Isoprop kommt aus einer frisch geöffneten, für noch nichts anderes und niemand anderem benutzten Flasche Rotipuran>99,8% p.a., viel Wasser sollte und kann da eigentlich gar nicht drin sein.
Bin mal gespannt wie sich das entwickelt.
Falls jemand noch grundsätzliche Tips zum Paraffineinbetten hat, gerne. Den Faden von Herrn Schulte kenne ich allerdings.

Nora

Ein update:
Ich hatte beschlossen daß die Trübung wohl richtig so ist, und hatte nun die Flasche etwa 1min bei RT, um die Probe rauszufischen und in reines Paraffin zu überführen. Stimmt, dann hab ich sie noch beschriftet, also noch mal 30sec dazu, und wieder zurück in den Wärmeschrank gestellt um später zu überlegen was ich damit mache. Nun hab ich zufällig nochmal in den Schrank geschaut, und es sind wieder zwei klare Phasen?! Es kann ja jetzt wohl nur ein minimaler Temperaturunterschied zu vorher sein, aber ich vermute hier die Ursache. Vielleicht sollte ich mal ein Thermometer in den Schrank legen, ob der wirklich die 62° hat die er anzeigt? Im Romeis steht die 1:1Mischung auch bei "nur" 60°, und scheint sich trotzdem zu mischen. Ich rätsle weiter.
Grüße,
Nora

Jürgen H.

Hallo Nora

Paraplast enthält neben Paraffin noch verschiedene Kunststoffanteile. Ich nehme an, dass es allein aus diesem Grunde Trübungen oder Ausflockungen mit Paraplast gibt. Klaus Henkels Anweisungen dürften sich jedoch auf reines Paraffin beziehen.

Ralf Feller hatte in der Vergangenheit einmal einen Versuch zur Löslichkeit von Paraplast in Iso gestartet. Sieh einmal hierzu und auch im Übrigen zur Paraffineinbettung:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4091.0

Schöne Grüße

Jürgen



Sascha D. F.

Hallo,

ich habe genau die gleichen Erfahrungen mit Paraplast gemacht.
Und als Chemiker weiß ich auch, wie man IPA trocknen kann.
Ich habe früher mit Kerzenwachs-Paraffinöl Mischungen gearbeitet und mit den Schmelzpunkt so eingestellt wie ich ihn brauchte. Da funktionierte es mit IPA, selbst wenn es noch 1 % Wasser enthielt.
Mein Paraplast liefert definitiv 2 Phasen mit Isopropanol (IPA).
Ich gehe davon aus, dass es sich nicht mehr um Paraffine handelt bei einigen Paraplastsorten
LG
Sascha

Klaus Henkel

Zitat von: Jürgen H. in Januar 13, 2015, 17:52:09 NACHMITTAGS

Paraplast enthält neben Paraffin noch verschiedene Kunststoffanteile. Ich nehme an, dass es allein aus diesem Grunde Trübungen oder Ausflockungen mit Paraplast gibt. Klaus Henkels Anweisungen dürften sich jedoch auf reines Paraffin beziehen.
Jürgen

Hallo Jürgen!
Nein das tun meine "Anweisungen" nicht. Wie kommen Sie denn darauf? Seit vielen Jahrzehnten schon ist die Verwendung von reinem Paraffin für Einbettungen nicht mehr üblich. Alle modernen Paraffinmischungen enthalten auch andere Anteile, z.B. um es geschmeidig zu halten. In meiner Amleitung habe ich das genau geschrieben:

Wenn in den folgenden Detaildarstellungen Paraffin oder reines Paraffin erwähnt ist, so ist damit immer eine der
arbeitserleichternden, modernen Paraffinmischungen gemeint, die aus reinem Paraffin und verschiedenen
plastischen Polymeren von bestimmten Molekulargewichten bestehen. Die letzten verbessern die Einbettungsund
Schneideeigenschaften gegenüber reinem Paraffin wesentlich. Das vorherige ,,Altern" des Paraffins durch
starkes Erhitzen im Thermostaten, wobei giftige Dämpfe entstehen, wie auch das anschließende Filtrieren und
Beimischen von Bienenwachs sind nicht mehr notwendig. Man wählt einfach eine moderne Paraffinmischung
mit Schmelzpunkt zwischen 54-60°C, vorzugsweise 55- 58°C.


@ Nora: In Ihrer Beschreibung der Prozedur kann ich die Schritte, die Sie aufzählen nur schwer und unsicher in einen Zusammenhang bringen mit den Prozeßschritten, die ich in meiner Anleitung mit Großbuchstaben bezeichnet habe. Würde es Ihnen etwas ausmachen, das zu ergänzen? Ich bin mir sicher, daß wir den Fehler finden können.

Grüße
KH




Jürgen H.

Hallo Herr Henkel,

als ich meine Vermutung äußerte, dass  Sie nur reines Paraffin meinen "dürften", kannte ich nur diesen Aufsatz hier:

http://www.klaus-henkel.de/paraffin-intermedien.pdf

Entschuldigen Sie Bitte, dass ich nicht Ihre Ansicht getroffen habe.

Ich habe zur Zeit einenkleinen Versuch laufen, da mich die S ache nun doch näher interessiert.

Ich habe je eine Mischung von Merckschen Paraffin56/58 und von Paraplast plus Mc. Cormick mit über Molekularsieb getrocknetem Iso 1 zu 1 hergestellt und im Wärmeschrank auf 60 Grad gehalten. Es bilden sich in beiden Fällen klare Lösungen von Paraffin und Iso . Es zeigen sich weiterhin in beiden Fällen deutliche Phasengrenzen, die darauf hinweisen, dass keine Vermischung der Stoffe stattfindet. Schüttele ich die Gläschen mit einer im Wärmeschrank vorgewärmten Tiegelzange, bilden sich Schlieren und Trübungen; letztere lösen sich zuerst im unteren Bereich der Flüssigkeiten auf.

Morgen sehe ich mir das näher an

Schöne Grüße

Jürgen

Nora

Hallo zusammen und herzlichen Dank für die weiteren Antworten!!!
Ich bin leider grad schwer anderweitig beschäftigt, werde mich aber so zeitnah wie möglich ausführlich melden und die Fragen beantworten.
Beste Grüße!

Nora

Jürgen H.

Guten Abend,

meinen oben beschriebenen Versuch habe ich zu Ende geführt. Er hat ergeben, dass beide von mir verwendete Paraffine sich jedenfalls nicht vollständig mit Iso mischen, wenn ich beide Stoffe  im Volumenverhältnis von etwa 1 zu 1 ansetze, nicht bei 60 Grad und nicht bei 62 Grad. Es bildet sich vielmehr eine deutlich sichtbare Phasengrenze aus. Der über der Phasengrenze liegende Teil der Flüssigkeiten klärt sich zudem nach Schütteln  nicht vollständig, sondern verbleibt auch nach über einer Stunde emulsionsartig, während der unterhalb der Phasengrenze liegende Teil völlig klar wird. Füge ich etwas Eosin hinzu, wird die Phasengrenze überaus deutlich.

Solange nicht geschüttelt oder gefärbt wird, fällt die Phasengrenze nicht schnell auf.

Wieviel Paraffin sich in Iso löst, kann ich nach meinem Versuch nicht sagen. Ich vermute aber, dass es nicht allzuviel sein kann. Die Phasengrenze teilt die Flüssigkeiten in etwa hälftig. Für einen Messversuch hätte ich das Volumen von Paraffin und Iso genau bestimmen müssen.

N-Butanol löst hingegen das Mercksche Paraffin von in etwa gleichem Volumen völlig klar. Auch Schütteln  ergibt keinerlei Trübung.

Schöne Grüße

Jürgen

Nora

So, jetzt nochmal.
Also Danke für den Link und die Versuche, es scheint also daß es sich nicht nur bei mir trennt, und es vermutlich am Paraplast liegt?
Als ich gestern nachsah, war die Phasengrenze milchig verwaschen, durch Schütteln wurde alles trüb und so ist es immernoch.
Wenn ich es recht verstehe, sollte aber eigentlich eine klare Lösung entstehen? Ist Paraplast damit für die Isomethode unbrauchbar? Meins ist iü von Leica, falls das was zur Sache tut.
Die Temperatur des Wärmeschranks konnte ich noch nicht überprüfen, da unser Laborthermometer verschollen ist, aber wie ich lesen konnte, trat der Effekt auch bei 70°C noch auf.

@Klaus Henkel: Es freut mich den Autor persönlich lesen zu dürfen (ich wußte gar nicht daß Sie hier noch aktiv sind)! Die Frage bezieht sich auf Schritt F in Ihrer Ausführung. Schritt E hatte ich modifiziert und die Probe mit Iso4 auf 62° erwärmt (nachdem sie allerdings schon 2h auf 45° war), da das Paraplast das ich bin dahin auf einer Wärmeplatte stehn hatte noch nicht ganz geschmolzen war und ich sehn wollte ob das im Wärmeschrank schneller geht, ich habe leider nur einen. Da meine Arbeitszeit zuende war und meine Kinderlein zuhause warteten, habe ich die trübe Mischung in genannte Flasche gefüllt und im Wärmeschrank übernacht stehn lassen, wo ich am nächsten Tag eben die getrennten Phasen vorfand. Ich bin mittlerweile bei Schritt H (der sich nun auf 18h ausgedehnt hat...) und werd nun versuchen, ob mir Schritt I gelingt... Infiltriert dürfte es nach den langen Zeiten wohl sein. Mal sehn.

Falls es noch Ideen gibt, gerne. Ansonsten scheint mir, daß ich für mein Paraplast wohl den "normalen" Weg mit Rotihistol nehmen sollte.
Ich hab von meiner Vorgängerin allerdings noch einen unbeschrifteten Beutel mit weißen Pellets gefunden, ich vermute daß es sich hierbei um Paraffin handelt, da kuck ich mal ob sich das in Isoprop löst... Ich weiß halt nicht was für ein Paraffin es ist, vielleicht ists ja auch Paraplast  ;D Naja, ich schau mal, mich würd halt interessieren wie es "richtig" aussieht, aber dafür muß ich mir vermutlich ein neues, definiertes Paraffin bestellen.
Ansonsten einfach nochmal Danke für die Hilfe!

Carsten Wieczorrek

Hallo,

@Jürgen
ZitatFür einen Messversuch hätte ich das Volumen von Paraffin und Iso genau bestimmen müssen.
Das hilft nichts um die Mischbarkeit zu bestimmen. Selbst wenn nachher beide Phasen jeweils 50% des Gesamtvolumens einnehmen, hat man eine Lösung von Paraffin in Isopropanol und eine Lösung von Isopropanol in Paraffin, die halt beide nicht miteinander mischbar sind.

Carsten
Für's grobe : GSZ 1
Zum Durchsehen : Amplival Hellfeld, Dunkelfeld, INKO, Phasenkontrast
Zum Draufsehen : Vertival Hellfeld, Dunkelfeld
Zum Polarisieren : Amplival Pol u Auf-/Durchlicht
Für psychedelische Farben : Fluoval 2 Auflichtfluoreszenz
Für farbige Streifen : Epival Interphako

Jürgen H.

Hallo Carsten,

Danke für den Hinweis. Zusätzliche Maßnahmen wären erforderlich. Z.B. Absaugen einer Phase, Wiegen  der verbleibenden Phase vor und nach Abdampfen des enthaltenen Isos?

Wie auch immer: Die Lösung von Paraffin in Iso funktioniert nur eingeschränkt und ich vermute, Dich als Chemiker wundert dies auch nicht.  Als praktische Konsequenz wäre zu fragen, in welcher Phase der Iso / Paraffinstufe Herrn Henkels Körbchen hängt.

All dies soll natürlich nicht heißen, dass die Isomethode untauglich ist.

Liebe Nora,

Das von mir auch verwendete Mercksche Paraffin ist m.E. ohne Kunststoffanteile.

Schöne Grüße

Jürgen


Carsten Wieczorrek

Hallo Jürgen,

ZitatZusätzliche Maßnahmen wären erforderlich. Z.B. Absaugen einer Phase, Wiegen  der verbleibenden Phase vor und nach Abdampfen des enthaltenen Isos?

Das wäre der experimentelle Weg. Man könnte aber auch in einem Fachbuch Physiaklische Chemie nachschlagen, wie das mit den Molvolumina war...
Aber dann könnte man auch in den tabellierten Löslichkeiten nachschlagen  ;D

Carsten
Für's grobe : GSZ 1
Zum Durchsehen : Amplival Hellfeld, Dunkelfeld, INKO, Phasenkontrast
Zum Draufsehen : Vertival Hellfeld, Dunkelfeld
Zum Polarisieren : Amplival Pol u Auf-/Durchlicht
Für psychedelische Farben : Fluoval 2 Auflichtfluoreszenz
Für farbige Streifen : Epival Interphako

Nora

Schnelles Zwischenupdate:
Ich habe das Unbekannte Paraffin geschmolzen und zimmerwarmes Iso dazugekippt (interessanter Effekt  ;D), aber eine halbe Stunde später war alles eine wunderbare, einheitliche, glasklare Flüssigkeit. Bei gegebenen 62°. Daraus schließe ich, daß das Unbekannte kein Paraplast ist, und die schlechte Mischbarkeit wirklich am Paraplast liegt.