DNA der Chloroplasten - mit Protokoll - zum Mitmachen

[paramecium]

Liebe Fluoreszenzler,

hier einmal etwas Mikrobiologie zum Anfassen und Nachmachen. Die Sicherheitshinweise zu den hier dargestellten Substanzen sind zu beachten, Nitril-Handschuhe sollten beim Präparieren getragen werden.

Aktuell diskutieren wir den Einfluss der Membrandurchlässigkeit bei der Fluoreszenzfärbung sowie die Möglichkeit der Färbung der DNA der Chloroplasten. Anhand einer nicht näher bestimmten Grünalge möchte ich diese Färbetechnik kurz darstellen und gleichzeitig die Leser auffordern, eigene Bilder hier anzuhängen um festzustellen, ob meine Methode auch mit anderen Fluorochromen, wie DAPI oder Acridinorange reproduzierbar ist. Also: Mitgemacht!

Methode:
Auf einen Objektträger werden nacheinander je 5 µl einer 1%-igen Lösung von Triton X-100 und 5 µl Hoechst 33342 30 µM gegeben. Darauf werden 25 µl einer Probe mit Algenfäden gegeben. Parallel wurde eine Probe mit Hoechst 33342 gefärbt, das Detergens Triton X-100 jedoch weggelassen. Nach ca. 15-30 Minuten Färbedauer werden die Proben verglichen und fotografiert.

Ergebnis:
In der mit Triton X-100 behandelten Probe sind bereits nach wenigen Minuten der Macronucleus und kleinere blau gefärbte Organellen sichtbar. In der Gegenprobe (letztes Bild) ist selbst nach längerer Färbedauer lediglich die Autofluoreszenz der Zellwand zu erkennen. Anhand der Gegenprobe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass die gefärbten, kleinen Organellen durch Autofluoreszenz abgebildet wurden. Somit ist sichergestellt, dass die blau dargestellten,kleinen Organellen offenbar mit dem DNA Fluorochrom gefärbt wurden. Die mit Hilfe des Detergens Triton X-100 behandelten Algen können wesentlich schneller und deutlicher gefärbt werden. Dieser Befund ist darauf zurückzuführen, dass die Zellkern umgebenden Membranen in der intakten Zelle nicht so durchlässig sind, dass der DNA Farbstoff diese ungehindert passieren kann. Zusatz des Detergens hilft diese Membranen durchlässig zu machen, so dass ein schnelleres Färbeergebnis erreicht ist. Die neben dem Zellkern (Macronucleus) gefärbte DNA ist auf das Vorhandensein von DNA in Chloroplasten und Mitochondrien zurückzuführen. Um die Abbildung von Bakterien DNA auszuschließen, sollte man sicher stellen, dass die Kamera nicht auf die Zelloberfläche sondern auf die Zellmitte mit dem Macronucleus fokussiert ist. Auf der äußeren Zellmembran sind oftmals "Aufsitzer" zu finden.

Modifikation:
Anstelle des Triton X-100 kann eine 1%-ige Lösung eines handelsüblichen Geschirrspülmittel probiert werden. Anstelle des Hoechst DNA-Farbstoffs können auch DAPI oder Acridinorange (5 µM) oder alternative Farbstoffe wie Sytox oder 7-AAD versucht werden. Ich bin gespannt auf Eure Ergebnisse.

Meine Ergebnisse:

Hellfeldaufnahme, Plan-Neofluar 40x/0.75 Ph2



UV-Anregung, Plan-Neofluar 40x/0.75 Ph2



UV-Anregung, Plan-Neofluar 40x/0.75 Ph2



UV-Anregung, Plan-Neofluar 100x/1.25 Ph3, Ölimmersion. Die DNA der Chloroplasten (eventuell auch Mitochondrien) ist gut erkennbar als neben dem Zellkern gefärbte, kleinere weiß-blaue Strukturen.



UV-Anregung, Plan-Neofluar 100x/1.25 Ph3, Ölimmersion. Um sicher zustellen, dass man keine bakterielle DNA abgebildet hat, sollte man bei der Fokussierung im Fluoreszenzmikroskop einige Übung haben. Hier abgebildet ist die Fokusebene der Zelloberfläche der Algenfäden auf der einige Bakterien als "Aufsitzer" ebenfalls blau leuchten.



UV-Anregung, Plan-Neofluar 40x/0,75 Ph2. Im letzten Bild, bei dem nur das Fluorochrom, nicht jedoch das Detergens verwendet wurde, ist lediglich eine Fluoreszenz an den Zellwänden erkennbar. Das DNA Fluorochrom dringt auch nach mehr als 30 Minuten nicht durch die Zellmembran. Weder Zellkern, noch andere Organellen erscheinen gefärbt. Auch eine Autofluoreszenz innerer Organellen ist nicht erkennbar. Daraus kann gefolgert werden, dass die Aufnahmen mit dem Detergens Triton X-100 tatsächlich gefärbte DNA zeigen.

[Rene]

Nice! Can you try it after a 70% ethanol fix? That should make it permeable as well.

Best wishes, René