BOTANIK: Prunus serrulata (Japanische Bergkirsche/Zierkirsche) *

othum · Januar 11, 2019, 13:07:00 NACHMITTAGS

Liebe Mikroskopie-Freunde,

heute wollte ich Euch nochmals einen sehr schönen Baum näher bringen: Die japanische Blütenkirsche oder auch Japanische Zierkirsche (Prunus serrulata).
Nochmals, da Hans-Jürgen hier schon vor ein paar Jahren einen sehr schönen Beitrag gezeigt hat:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=18295.msg139719#msg139719
Dort finden sich auch die korrekten, detaillierten Bestimmungen der Zelltypen, sowie eine ganze Menge Hintergrundinformationen, auf die ich hier gerne verweisen möchte.
Ein paar zusätzliche Informationen habe ich aber vielleicht auch dabei, daher ein neuer Beitrag.

Beginnen möchte ich – als Nicht-Biologe - mit einer Frage, da sie vielleicht zwischen den Bildern untergehen würde: Bei meinen Schnitten (insbesondere bei den gefärbten sehr gut zu sehen) finde ich unterhalb des Periderms eine weitere, bis zu ca. 80 µm große Schicht, die sich sowohl vom Periderm als auch vom Rindenparenchym abhebt. Was kann das sein? Ist das Kork?

Zunächst gibt es gar nicht ,,die" japanische Blütenkirsche. Alleine die deutsche Wikipedia ( https://de.wikipedia.org/wiki/Japanische_Blütenkirsche ) zählt 24 Varianten plus einige Züchtungen. Leider ist der Link in Hans-Jürgens Beitrag nicht mehr funktional, daher weiss ich nicht, um welche Variante es sich bei ihm handelte.

Während der Blütezeit sind die japanischen Kirschbäume eine reine Augenweide, die vermehrt auch in Europa Einzug in Gärten gefunden haben. Aber nicht nur in Gärten, sogar als Strassenbegrünung: Zu meiner Bonner Studentenzeit (in den 90ern) waren die in den 80er Jahren gepflanzten Bäume (https://www.kirschbluete-bonn.de/ ) noch ein Geheimtipp, heute kann man vor Touristenmassen die Bäume fast gar nicht mehr sehen... (Das entsperchende menschenleere Foto auf Wikipedia wurde auch schon 2006 aufgenommen).

Mich verfolgt der Baum schon länger. Vor etwa 35 Jahren habe ich mit meinem Vater ein kleines Bäumchen im heimischen Garten gepflanzt, welches sich bis heute prächtig entwickelt hat:
Bild 1:

.
Der Baum war zwischenzeitlich (aktuell hat er ein paar Sturmschäden) etwa 9m hoch, das Foto stammt aus dem April 2018 mit noch etwa 8m Höhe.

Weil ein solch großer Baum mit dem typischerweise handtuchgroßen Garten des modernen Grossstadt-Reihenhausbewohners inkompatibel ist, habe ich vor etwa 15 Jahren eine kleinere Variante in meinen eigenen Garten gepflanzt:
Bild 2:

.
Hierbei handelt es sich um eine hängende Variante (,,Kiku-Shidare-Sakura"), die auf den Stamm eines (vermutlich) Apfelbaums gepropft ist. Das hält das Wachstum in natürlichen Grenzen, führt aber trotzdem zu reichlich Grünschnitt, da die Triebe etwa 50cm oder mehr pro Jahr wachsen. Auch dieses Foto stammt aus dem April 2018.

Material & Methoden:
Die Proben wurden im November, also nach der Wachstumsperiode, an einjährigen Trieben genommen und frisch verarbeitet. Geschnitten wurde mit einem HN40 Schlittenmikrotom mit Leica Einmalklingen auf 30µm Schnittdicke.

Die ungefärbten Schnitte wurden 3x in Wasser gewaschen und dann in Wasser eingedeckt und mikroskopiert.
Ansonsten wurden die Schnitte 3x in Wasser, 3x in 30% EtOH gewaschen, zurück in Wasser überführt und in W3Asim I gefärbt (7 Min mit einmaligem Erwärmen), mit Wasser gewaschen, in iPrOH überführt und in Euparal eingedeckt und im Wärmeschrank bei 50°C ausgehärtet.

Verwendet wurde ein Zeiss Axiovert S100 mit LD Kondensor 0.55 (Ph/DIC), DL-Halogenbeleuchtung (auf Maximum) mit KB15 Filter, bzw. HBO100 zur AL-FL mit IR Sperrfilter und Blauanregungs-Filtersatz (BP450-490; FT 510, LP515), Trinokulartubus mit 2.5x Projektiv zur Ausleuchtung des ,,Vollformats". Als Kamera dient eine Pentax K-1 (36MPx Vollformat), Aufnahmen im RAW Format, ausgelöst mit Fernbedienung und elektrischem Verschluss.
Objektive: A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; LD-Achroplan 20x/0.40 Korr. Ph2; EC Plan Neofluar 40x/0.75.
Bei Aufnahmen mit dem Neofluar 10x wurden in der Regel Stacks mit einem Aufnahmeabstand von 2µm erstellt; bei Aufnahmen mit dem Neofluar 40x Stacks mit einem Aufnahmeabstand von 0.7µm
Die Aufnahmen wurden in Lightroom CC Classic entwickelt (Weißabgleich, Belichtungskorrektur), auf 9MPx verkleinert und als TIFF exportiert. Gestackt wurde mit Helicon Focus Pro 6.8.0 (Methode B), gestitcht mit PTGui Pro 11.9. In Photoshop CC wurde ggf. freigestellt und der Maßstab eingefügt. Zurück in Lightroom wurde geschärft und fein geschliffen sowie als JPG exportiert (verkleinert auf 1024Px Breite für das Forum). Die hochaufgelösten Webversionen wurden mit krpano 1.19 erstellt.

Ergebnisse

Anfangen möchte ich mit einem Schnitt von etwa 3mm Durchmesser, der in der Nähe einer Knospe (dazu später mehr) aufgenommen wurde. Die Aufnahmen im einfachen HF oder DF (A-Plan 5x/0.12) zeigen schon, dass zumindest am Ende der Wachstumsphase eine ausgesprochen kräftige Rinde von etwa 80µm ausgebildet wurde, die das Schneiden der Proben echt zu einer Herausforderung macht (nach schon 3-4 Schnitten war die Einmalklinge deutlich abgestumpft!):

Bild 3:

Bild 4:

Auch die Primärfluoreszenz im AL (A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; EC Plan Neofluar 40x/0.75) zeigt – neben dem Chlorophyll, die kräftigen Ligninbereiche:
Bild 5:

Bild 6:

Bild 7:

Im Phasenkontrast (LD-Achroplan 20x/0.40 Korr. Ph2) nicht viel zu sehen (zumindest für mich):
Bild 8:

Nun zu den gefärbten Schnitten. Zunächst ein Schnitt (EC-Plan-Neofluar 10x/0.30) etwas weiter Richtung Sprossende im Vergleich zum ersten Schnitt. Der Durchmesser ist etwa kleiner (etwa 2.3mm) und die Strukturen symmetrischer, da nicht von einem Knospenansatz ,,gestört".
Bild 9:

Hier das Ganze als hochaufgelöste Version (6 Stapel á 11 Bilder, verkleinert auf 40Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/09/index.html

Hier zeigt sich ein kleines Problem bei meinen Präparaten: Ich habe doch nach dem Färben bei allen Schnitten ,,Löcher" oder ,,Risse", insbesondere im Bereich des Rindenparenchyms und des Phloems. Dickere Schnitte sind zwar robuster, färben aber nicht mehr schön an. Durch den hohen Ligningehalt sind sie nach W3Asim I vor allem rot (trotz deutlicher Reduktion des Acridinrotanteils....). Wer hier hilfreiche Tipps hat: Nur her damit!

Hier noch zwei Ausschnitte (EC Plan Neofluar 40x/0.75):
Bild 10:

Bild 11:

Das Ganze im DF (für mich ästhetisch immer die schönsten Aufnahmen, EC-Plan-Neofluar 10x/0.30):
Bild 12:

Und in AL-FL (EC-Plan-Neofluar 10x/0.30):
Bild 13:

Ausschnitt (EC Plan Neofluar 40x/0.75)
Bild 14:

Der dritte Schnitt liegt jetzt wieder in der Nähe des ersten (Durchmesser knapp 3mm) in der Nähe einer Knospe.
Hier die Übersichtsaufnahme (EC-Plan-Neofluar 10x/0.30) im HF, DF und AL-FL:
Bild 15:

Hier gibt es noch eine hochaufgelöste Version (11 Stapel á 11 Bilder, verkleinert auf 60Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/15/index.html

Bild 16:

Bild 17:

Und zwei Ausschnitte der AL-FL, einmal mit dem EC-Plan-Neofluar 10x/0.30, einmal mit dem EC-Plan-Neofluar 40x/0.75:
Bild 18:

Bild 19:

Nun wurde ich, was die Schnitte angeht, mutig. Nun ein Schnitt durch den Knospenansatz, Länge des Schnitts hier etwa 5 mm.
Übersichtsaufnahme (A-Plan 5x/0.12) im HF:
Bild 20:

Hier als hochaufgelöste Version (Pano aus 10 Aufnahmen, verkleinert auf 36Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/20/index.html

Hier ein interessanter Ausschnitt (EC-Plan-Neofluar 10x/0.30)
Bild 21:

Und als hochaufgelöste Version (4 Stapel á 11 Bilder, verkleinert auf 25Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/21/index.html

Und ein weiterer Ausschnitt mit dem 40er:
Bild 22:

Auch hier darf das entsprechende DF-Bild nicht fehlen:
Bild 23:

Hier als hochaufgelöste Version (Pano aus 10 Aufnahmen, verkleinert auf 36Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/23/index.html

Und in AL-FL:
Bild 24:

Hier als hochaufgelöste Version (Pano aus 10 Aufnahmen, verkleinert auf 36Mpx):
http://www.thum.li/Mikro/Prunus/24/index.html
Zum Schluss noch zwei Ausschnitt der AL-FL, einmal mit dem EC-Plan-Neofluar 10x/0.30, einmal mit dem EC-Plan-Neofluar 40x/0.75:
Bild 25:

Bild 26:

Viel Spaß beim Betrachten: Ich freue mich über Anregungen, Kommentare und Verbesserungsvorschläge!

cu Oliver

Rawfoto · Januar 11, 2019, 13:42:38 NACHMITTAGS

Hallo Oliver

Mir gefällte, habe auch die großen Bilder gerne angesehen👍

Anregungen:

Eine Schnittdicke im Bereich von 0,035 bis 0,050mm eignet sich für UV Anregung besser
Du musst gerade bei UV Anregung auf die Lichter achten, die Stackingsoftware ist da generell sehr empfindlich. Tipp, vorher die Lichter reduzieren und das Ergebnis wieder anheben und Du wirst überrascht sein. Das bringt noch einmal einen Zeichnungsgewinn

Du hast zum Teil eine tolle Räumlichkeit, ist bei Stacks nicht selbstverständlich👌

Liebe Grüße

Gerhard

Fahrenheit · Januar 11, 2019, 14:17:52 NACHMITTAGS

Lieber Oliver,

vielen Dank für deinen schönen Beitrag, den ich gerne in die Liste Botanik übernommen habe.

Bei der von Dir angesprochenen Zellschicht handelt es sich m.E. tatsächlich um Korkzellen des unter der Epidermis bereits gebildeten Periderms. In der nächsten Wachstumsperiode wäre die Epidermis sicher aufgesprungen und hätte die Korkschicht des sekundären Abschlußgewebes frei gegeben.

Herzliche Grüße
Jörg

othum · Januar 11, 2019, 14:20:41 NACHMITTAGS

Hallo Gerhard

Zitat
Mir gefällte, habe auch die großen Bilder gerne angesehen👍

Danke!

ZitatAnregungen:

Eine Schnittdicke im Bereich von 0,035 bis 0,050mm eignet sich für UV Anregung besser

Und das, wo Du ein Deinem Buch (was übrigens mit ein Grund ist, warum ich mich jetzt für die Mikrofotografie begeistere!) 10-20µm empfiehlst

ZitatDu musst gerade bei UV Anregung auf die Lichter achten, die Stackingsoftware ist da generell sehr empfindlich. Tipp, vorher die Lichter reduzieren und das Ergebnis wieder anheben und Du wirst überrascht sein. Das bringt noch einmal einen Zeichnungsgewinn

Danke! Habe ich in dem Fall sogar schon getan, allerdings noch nicht auf die Spitze getrieben. Gere im Bereich der FL-Mikroskopie optimiere ich noch meinen Workflow (auch aufgrund meiner etwas defekten AL-Einheit), daher werde ich das auf jeden Fall ausprobieren!

ZitatDu hast zum Teil eine tolle Räumlichkeit, ist bei Stacks nicht selbstverständlich👌

Freut mich, dass es Dir gefällt. Geht mir inn dem Fall tatsächlich auch so

cu Oliver

Rawfoto · Januar 12, 2019, 12:38:46 NACHMITTAGS

Hallo Oliver

Natürlich ist im Zusammenhang mit UV-Anregung dünner als 0,035mm toll - dazu braucht man aber ein entsprechendes Mikrotom. Die 0,035 mm gehen auch noch mit einem an den Tisch geschraubten Handmikrotom.

Hast Du denn ein Standgerät?!?

Schön das Dir unser Buch gefällt und das es anregend gewirkt hat

Liebe Grüße

Gerhard

othum · Januar 12, 2019, 12:42:38 NACHMITTAGS

Hallo Gerhard

Zitat von: Rawfoto in Januar 12, 2019, 12:38:46 NACHMITTAGS
Natürlich ist im Zusammenhang mit UV-Anregung dünner als 0,035mm toll - dazu braucht man aber ein entsprechendes Mikrotom. Die 0,035 mm gehen auch noch mit einem an den Tisch geschraubten Handmikrotom.

Hast Du denn ein Standgerät?!?

Ach so, ist vielleicht im Text untergegangen. Das sind bereits 0.030mm Schnitte mit einem Schlittenmikrotom. Insofern war ich verwirrt, dass Du mir dickere Schnitte empfohlen hast....

cu Oliver

Rawfoto · Januar 12, 2019, 16:34:59 NACHMITTAGS

Du hast Recht Oliver,
die 0,080 mm von oben sind mir in Erinnerung geblieben - mein Fehler. Die Schnitte wirken dicker. Hast Du beim Schneiden das Schnittmaterial auf einen Holzblock geklebt?

Liebe Grüße
Gerhard

Rolf-Dieter Müller · Januar 12, 2019, 22:18:24 NACHMITTAGS

Hallo Oliver,

ich genieße jedes Jahr einen Spaziergang durch die Alte Heerstraße in Bonn. Vorzugsweise bei Sonnenschein unter dem gewaltigen Blütendach und freue mit den vielen Menschen, die dieses Naturschauspiel ebenfalls würdigen.

Im übrigen wieder ein schöner Schnitt und super Mikroaufnahmen. Da sieht man direkt den Vorteil Deiner Vollformat mit den vielen Pixeln.

Eine Frage habe ich aber. Bild 5 hast Du mit Primärfluoreszenz gekennzeichnet. Mir sieht hierfür das Chlorophyll bei der angegebenen Blauanregung etwas zu flach aus. Entspricht die Farbigkeit von Bild 5 in etwa auch Deinem visuellen Eindruck den Du hast, wenn Du durch das Okular siehst?

Viele Grüße,
Rolf-Dieter

othum · Januar 13, 2019, 11:25:42 VORMITTAG

Hallo Rolf-Dieter,

Zitat von: Rolf-Dieter Müller in Januar 12, 2019, 22:18:24 NACHMITTAGS
Im übrigen wieder ein schöner Schnitt und super Mikroaufnahmen.

Vielen Dank!

ZitatEine Frage habe ich aber. Bild 5 hast Du mit Primärfluoreszenz gekennzeichnet. Mir sieht hierfür das Chlorophyll bei der angegebenen Blauanregung etwas zu flach aus. Entspricht die Farbigkeit von Bild 5 in etwa auch Deinem visuellen Eindruck den Du hast, wenn Du durch das Okular siehst?

Die Aufnahmen sind in der Tat aus mehreren Gründen schwierig. Zum einen bastele ich noch an der halbwegs gleichmäßigen Ausleuchtung (die frischen Schnitte habe ich schon im November gemacht und fotografiert, heute wäre ich schon etwas weiter. Hier sieht man zB noch deutliche Vignettierungen). Zum anderen nimmt die stark lignifizierte Rinde so viel Farbstoff auf, dass sie unglaublich hell ist und daher zu deutlichen Überstrahlungen führt, wenn man bei der Aufnahme nicht aufpasst. Daher sind die Einzelaufnahmen absichtlich unterbelichtet, die Lichter dann nochmal deutlich runtergeregelt, um die Epidermis halbwegs vernünftig darzustellen. Das führt natürlich auch dazu, dass der Rest dunkler und weniger kontrastreich wird.

Ich habe Bild 5 nochmal neu entwickelt, viel mehr lässt sich leider nicht rausholen:

Allerdings bei dem Ausschnitt (Bild 7), da ging noch was:

Schließlich stellt sich mit die Frage: Kann es sein, dass zum Zeitpunkt der Probennahme (Ende November) der Chlorophyllgehalt auch recht übersichtlich ist und während der Wachstumsphase (und bei mehr Sonnenlicht) mehr Chlorophyll gebildet wird?

cu Oliver

Klaus Herrmann · Januar 13, 2019, 11:51:13 VORMITTAG

Hallo Oliver, wirklich sehr schöne Scnitte , Färbungen und Aufnahmen. Da hast du ne Menge Arbeit reingesteckt. Mein Favorit ist die 20, aber auch die DF-Aufnahmen sind ausgesprochen attraktiv.
20 wäre für mich ein Kandidat fürs BDM Januar.

ZitatZum anderen nimmt die stark lignifizierte Rinde so viel Farbstoff auf, dass sie unglaublich hell ist und daher zu deutlichen Überstrahlungen führt,

Dieser Satz bezieht sich doch eigentlich auf ein Bild das Autofuoreszenz zeigen soll? Dann verstehe ich ihn nicht, weil Autofluoreszenz doch von einem ungefärbten Objekt ausgeht.

othum · Januar 13, 2019, 11:55:34 VORMITTAG

Hallo Klaus,

Zitat von: Klaus Herrmann in Januar 13, 2019, 11:51:13 VORMITTAG
Hallo Oliver, wirklich sehr schöne Scnitte , Färbungen und Aufnahmen. Da hast du ne Menge Arbeit reingesteckt. Mein Favorit ist die 20, aber auch die DF-Aufnahmen sind ausgesprochen attraktiv.
20 wäre für mich ein Kandidat fürs BDM Januar.

Vielen Dank!

Zitat
ZitatZum anderen nimmt die stark lignifizierte Rinde so viel Farbstoff auf, dass sie unglaublich hell ist und daher zu deutlichen Überstrahlungen führt,
Dieser Satz bezieht sich doch eigentlich auf ein Bild das Autofuoreszenz zeigen soll? Dann verstehe ich ihn nicht, weil Autofluoreszenz doch von einem ungefärbten Objekt ausgeht.

Gut aufgepasst! Da hast Du natürlich vollkommen Recht, da war ich eben in Gedanken schon woanders. Ich meinte natürlich die Autofluoreszenz der Rinde, bzw der in der Rinde enthaltenen Stoffe.

cu Oliver

othum · Januar 13, 2019, 12:08:51 NACHMITTAGS

Hallo Gergard,

Zitat von: Rawfoto in Januar 12, 2019, 16:34:59 NACHMITTAGS
Du hast Recht Oliver,
die 0,080 mm von oben sind mir in Erinnerung geblieben - mein Fehler. Die Schnitte wirken dicker. Hast Du beim Schneiden das Schnittmaterial auf einen Holzblock geklebt?

Die starke Rinde (zumindest zu dieser Jahreszeit) ist Fluch und Segen gleichermaßen: Die Proben sind stabil genug um freistehend (ohne weitere Hilfsmittel) geschnitten zu werden. Allerdings wird es (zumindest für mich) schwierig, noch dünnere Schnitte als die 30µm zu erhalten. Und der Klingenverschleiss ist recht hoch....

Zum Vergleich, hier ein etwas dickerer (70µm), älterer Schnitt (die Aufnahmen habe ich gerade auf die Schnelle gemacht, Pano aus 6 Aufnahmen mit dem A-Plan 5x/0.12, nicht aufgehübscht). Die Probe stammt aus dem Oktober und wurde 3 Wochen in AFE fixiert. Dann auf einem Handmikrotom mit Einmalklingen im SHK Halter geschnitten (weniger als 70µm habe ich hier nicht hinbekommen) und wie gewohnt in W3ASim I gefärbt und in Euparal eingedeckt:

Hier sieht man nun, dass der Schnitt deutlich dicker ist und vor allem für meinen Geschmack viel zu viel roten Farbstoff aufnimmt (ich hatte auch experimentiert und den Acridinrotanteil deutlich reduziert, leider ohne Erfolg). Interessant ist, dass die Aufnahme etwas mehr Ähnlichkeit zu Hans-Jürgens Aufnahmen (dort wohl ein 40µm Schnitt) hat.

cu Oliver

othum · Januar 13, 2019, 12:18:17 NACHMITTAGS

Hallo Gerhard

Zitat von: Rawfoto in Januar 11, 2019, 13:42:38 NACHMITTAGS
Du musst gerade bei UV Anregung auf die Lichter achten, die Stackingsoftware ist da generell sehr empfindlich. Tipp, vorher die Lichter reduzieren und das Ergebnis wieder anheben und Du wirst überrascht sein. Das bringt noch einmal einen Zeichnungsgewinn

Nachtrag:
Ich hatte in meiner Antwort auf Rolf-Dieters Hinweis noch mal einen Stack der Primärfluoreszenz gezeigt, der auf neu entwickelten Einzelbildern beruht.
Hier der Einfachheit halber noch Mal:

Die Lichter waren vorher schon maximal reduziert, aber ich habe dieses Mal noch die Gesamt Belichtung um 2EV gesenkt. Da kommt tatsächlich deutlich mehr Zeichnung raus!

cu Oliver