Histologie der Insekten Teil 2

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
jeder Organismus, den man untersuchen will braucht angepasste Methoden
der Präparation und in der Histologie, der Fixierung. Die in der Pathologie
übliche Fixierung mit 4% Formalin stößt schon bei Vögeln, Fischen und erst
recht bei Insekten an ihre Grenzen.

Als Modellorganismus zum Austesten habe ich die ägyptische Wanderheuschrecke
Locusta migratoria gewählt, weil sie in Zoohandlungen als Futtertier verkauft wird.



Erste Bilder aus dem Kopfbereicht habe ich schon im letzten Dezember gezeigt.

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35944.0

Jetzt möchte ich ein paar Bilder aus dem anschließenden Forder-, Mittel-,
und Hinterdarm zeigen.

Der Vordarm wird allgemein aus dem Pharynx, der Speiseröhre, dem Kropf
und dem Proventriculus gebildet.
Die Speiseröhre ist im Grunde ein Rohr, das über den Kropf und den Proventriculus
oder gizzard zum mittleren Darm führt.  Der Kropf ist einfach ein Lagerbereich und
der Proventriculus, oder gizzard, ist eine muskulöse Erweiterung des Kropf. 
In jenen Insekten, die sich von festen Lebensmitteln ernähren, wird er verwendet
um die Nahrung zu kleineren Partikeln zu mahlen und sie in den Mitteldarm (midgut),
aus Ventriculus, und Darm zu leiten.

Vom Magen werden mehrere Blindsäcke, die Magen-Caecae, abgegeben. Sie laufen
neben Proventriculus und Magen.
Die Magencaecae dienen dazu, die Oberfläche des Mitteldarms zu vergrößern und
damit sowohl seine Fähigkeit Verdauungsenzyme zu sezernieren, als auch seine
Fähigkeit, nützliche Produkte aus der teilweise verdauten Nahrung zu extrahieren,
zu erhöhen.

Der Mitteldarm geht in den Hinterdarm über. Der Hinterdarm besteht aus dem "Darm",
in dem ein Großteil der Diffusion in den Insektenkörper auftritt. Das "Rektum",
komprimiert unverdaute Lebensmittel und Abfallprodukte und extrahiert gegebenenfalls
Wasser daraus, bevor die Fäzes durch den "Anus" ausgeschieden wird.





Die aus dem vordersten Teil des Hinterdarms entstehenden Malpighian Tubuli (benannt nach Malpighi, der sie entdeckte) haben überhaupt nicht wirklich mit Verdauung zu tun, sondern mit Eliminierung. Sie wirken wie unsere Nieren und extrahieren  Abfallprodukte (meist stickstoffhaltige Produkte wie Harnstoff und Harnsäure) aus der zirkulierenden Körperflüssigkeit, der Hämolymphe, und scheiden sie in den Hinterdarm aus.

Obwohl Insekten eine große Anzahl von Verdauungsenzymen besitzen, werden sie oft durch das Vorhandensein von symbiotischen Mikroorganismen, wie Protozoen und Bakterien,bei Verdauungs- und Anpassungsprozessen unterstützt.

Abb. 1 zeigt noch einmal die Speiseröhre im Halsbereich.
Die Zellen zeigen einen dichten Besatz mit Mikrovilli.

Abb. 1


Abb. 2  zeigt den Proventrikulus mit 6 begleitenden gastric caecae

Abb. 2


Abb. 3 ist eine Vergrößerung

Abb. 3


Abb. 4 zeigt eine Vergrößerung des Proventrikulus.
Es fällt die starke Ringmuskulatur auf. Vom Säugetier kennen wir eine innere
Ringmuskelschicht und eine äußere Längsmuskelschicht, so wie Bindegewebe
unter den Epithelzellen. Das scheint hier nicht so zu sein. Die innere Wand ist
mit einer dicken Chitinschicht zum zermahlen der Nahrung versehen.
Was auch erstaunt, ist die ausgesprochen gute Ausnutzung der Nahrung.
Beim Menschen kann man selbst im Stuhl noch Pflanzenzellen und Leitbündel
erkenne, das ist hier nicht so.

Abb. 4


Abb. 5 zeigt die Zellen der gastric caecae.
Es handelt sich um ein einschichtiges Zylinderepithel mit deutlichem
Mikrovillisaum. Die Sauerstoffversorgung erfolgt über mit Luft gefüllte
Tracheen und nicht durch Blutgefäße. Einige Vesikel lassen auf eine
Sekretion schließen.

Abb. 5


Abb. 6 zeigt den Mitteldarm. Ob es im Mitteldarm eine Differenzierung
zwischen Ventrikulus und dem übrigen Mitteldarm gibt kann ich heute
noch nicht sagen weil ich nicht kontinuierlich geschnitten habe. Bei einem
1cm langen Insekt und einer Schnittdicke von 1µ wären das 10 000 Schnitte
geworden.

Abb. 6


Abb. 7 und 8 zeigen eine Vergrößerung aus der Mitteldarmwand.
Einen besonders guten Kontrast bekommt man wenn man das Bild in
Graustufen umwandelt. Wir haben ein einschichtiges, mehrreihiges
Zylinderepithel mit Regenerationszellen an der Basis. Ich glaube hier
eine innere Ring- und äußere Längsmuskelschicht zu erkennen.
Dann ist da eine dünne unterbrochene Schicht (?) basal, die von der
Färbung wie Muskulatur aussieht. Beim Menschen hat man da eine
Lamina muscularis mucosae. Ich sehe aber keine Zellkerne.

Abb. 7


Abb. 8


Abb. 9 zeigt eine PAS Färbung auf Mucine, diese fällt aber negativ aus.

Abb. 9


Mit Abb. 10 und 11 kommen wir in den Hinterdarm.
Hier wird der Wandaufbau viel einfacher. Es findet sich eine schwache
Muskulatur und die Zellen scheinen von einer Chitinschicht bedeckt
zu sein. Im Darminhalt finden sich nun viele Bakterien.

Abb. 10


Abb. 11


Abb. 12 zeigt das es wohl weiter caudal zu blumenkohlartigen
Einstülpungen kommt.

Abb.12


Abb. 13 zeigt die Malpighian Tubuli die in diesem Bereich als
Ausscheidungsorgane viel mehr Granulationen zeigen als cranial.

Abb. 13


Material und Methoden

Fixierung
Ich habe mehrere Fixantien ausprobiert darunter alkoholische wie AFE
und Glutaraldehyd + Formaldehyd in Phosphatpuffer.
Die besten Ergebnisse konnte ich mit 4% Formaldehyd + 5% Glutaraldehyd
in Phosphatpuffer erreichen, s. Abb. 14

Abb. 14


Die Tiere wurden mit CO2 betäubt und dann komplett in das kalte Fixans
geworfen. Im Fixans habe ich Beine und Flügel abgetrennt und eine Stunde
im Kühlschrank belassen. Danach wurde das Insekt in Kopf, Thorax und
Abdomen geteilt (macht man das zu früh entstehen Quetschungen) und weitere
12h im Kühlschrank fixiert.

Dann folgte die Isopropanolreihe bis 99%, 100% Ethanol,
Einbettung in LR White wie im ersten Faden beschrieben.
Die Proben wurden in einen Rundprobenhalter für die Elektronenmikroskopie
eingespannt und mit dem Dremel angeschnitten, s. Abb. 15

Abb. 15


Geschnitten wurde mit einem Ultracut R, Abb. 16 und einem
automatischen Rotationsmikrotom SuperCut 2050 mit Retraktion, Abb.17
Abb. 18 V-Element für Rundprobenhalter

Abb. 16


Abb. 17


Abb. 18


Schnittdicke war 1µ, dabei sind die Schnittergebnisse beider Geräte in
diesem Bereich identisch. Das Rotationsmikrotom ist allerdings universeller
wenn man die verschiedenen Proben- und Messerhalter hat. Man kann dann
eigentlich alles damit schneiden. Das Ultra ist in der Bedienung einfacher,
aber man kann damit nur Kunststoffe schneiden.
Kauft man solche Geräte, so muss man unbedingt darauf achten, das ein
Steuerpult dabei ist, sonst hat man nur Altmetall, es lässt sich nicht einmal
die Schnittdicke manuell einstellen.

Zuletzt möchte ich meinem lieben Kollegen Jürgen Harst noch für die
vielen wertvollen Kommentare zur Insektenhistologie danken.

Teil 3
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39376.0

viele Grüße aus Mülheim-Ruhr, Ralf

[deBult]

Impressive work, thank you for showing.

Best, Maarten

[JürgenG.]

Dankeschön für diese Vorstellung, hochinteressant und aufschlussreich.

Wieviel Zeit hast du in dieses Projekt investiert?

Gruß Jürgen

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

das ist ein ganz fantastischer Beitrag von Dir mit so schönen aussagekräftigen Bildern.

Da ich von Dir ja auch ein paar Schnitte aus der von Dir geschnittenen Serie besitze, möchte ich bebildert auf zwei Punkte noch besonders hinweisen:

Der Proventriculus, den Du so schön geschnitten hast, weist innerhalb des Aufbaus seiner faltigen Wand eine Besonderheit auf: Es gibt neben gewöhnlichen Falten große Auffaltungen, die ins Lumen hineinspringen.



Diese Gebilde besitzen innen eine Muskulatur, die sich von Seite zu Seite erstreckt (Pfeil) und von der ich mir denke, dass sie die Falte nach innen vorspringen lässt, wenn sie sich zusammenzieht.

Auffällig ist auch, dass die Intima farblich differenziert dargestellt ist, nämlich dass die Färbung zur Lumenseite des Darms stärker ausfällt, als zum Darmepithel hin. Da der Proventriculus aus dem Ektoderm stammt, zeigt sich hier wohl die chitinöse Auskleidung des Darms, die zudem noch einige erkennbare Dornen besitzt: Sinnvoll im Zusammenhang mit der Aufgabe des Proventriculus, die festen Darmbestandteile zu zerkleinern.

Du schreibst bereits, dass die Längsmuskulatur  beim Proventriculus zu fehlen scheint: Sie scheint mir - sehr schwach ausgebildet - doch jeweils in den Bereichen zwischen den Caecaquerschnitten vorhanden zu sein (Pfeile):




Mehr an Muskulatur ist vielleicht nicht nötig, weil die chitinöse Intima selbst als Antagonist der Ringmuskulatur wirkt?

Mir fällt bei Deinen Bildern auf, dass sich in den Caeca keinerlei Nahrungsbestandteile befinden. Offenbar dienen sie nur als Drüsen oder als Resorptionsorgane. Hast Du einen Schnitt vom Eingang in die Caeca? Gibt es dort einen Verschlussmechanismus?

Schöne Grüße

Jürgen

[Reinhard]

Hallo Ralf,

großartige, interessante Arbeit und sehr schöne histologische Bilder.

Viele Grüße
Reinhard

[Soki]

Wunderbar! Sehr ausführlich und anschaulich.

beste Grüße,
Simon

[reblaus]

Hallo Ralf -

tolle Fortsetzung von Deinem Neujahrsbeitrag!

Viele Grüße

Rolf

[Ronald Schulte]

Wunderbarer Beitrag Ralf.

Abbildung 14 zeigt deutlich, warum man Eukaryotisches histologisches Material nicht mit Alkohol fixieren soll. Das Formaldehyd mit Glutaraldehyd ergibt hier eindeutig eine bessere Gewebemorphologie. Gut dargestellt.

Abbildung 5 zeigt möglicherweise ein Sekret in den Fragezeichen. Ich glaube, dass ich in Jürgens Bild die gleichen Kugeln sehe. Wenn es ein Sekret ist, um welche Art von Zellen handelt es sich dann? Ich würde hier Schleimhautzellen erwarten, aber ich sehe die auch nicht.

Abbildung 8 ist in Schwarzweiß und ist eigentlich das meist detaillierte Bild finde ich. Bei der Zelllinie am Fragezeichen könnte es sich vielleicht um eine quer durchgeschnittene dünne Muskelschicht handeln. Vielleicht um eine Längsbewegung im Darm zu erreichen? Jürgen schreibt auch etwas in der Richtung, wie ich es gelesen habe.

Schade, dass du die Hoden und/oder Eierstöcke noch nicht angeschnitten hast. Ich habe das hier schon einmal gezeigt, und das ist morphologisch auch sehr interessant.

Mit DAPI kann man das perfekt inkubieren, und es ist schön, mit Fluoreszenz an zu sehen.

Ein Niederländischer Kollege von mir sucht noch nach einer Art Klemme wie auf Bild 18. Er möchte dort Technovit histo-Blöcke einspannen können. Weist du noch was?

Grusse Ronald

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
vielen Dank für Euer Lob für diese kleine Arbeit.

@JürgenG
Lieber Jürgen, wie viel Zeit, das ist doch relativ, wie lange braucht man um
gute Bilder zu machen, wie lange um einen perfekten Stack hin zu bekommen
oder einen DIC perfekt einzustellen? Das LR White habe ich im Oktober 2019
gekauft und an den Wochenenden die richtige Fixierung und Einbettung
ausprobiert, im Dezember den Kopf und im Januar und Februar das Abdomen
bearbeitet, das ist doch nicht so lange, und jetzt gehr alles viel schneller.

@JürgenH
Lieber Jürgen, Du schaust immer ganz genau hin und hinterfragst alles,
deshalb schätze ich Dich so sehr!
Auf den ,,Faltenmechanismus im Proventrikulus währe ich so nicht gekommen.
Das ? in Abb. 8 war extra für Dich.



Es ist doch:
1: äußere Längsmuskulatur
2: innere Ringmuskulatur
und was ist 3, vielleicht so etwas wie die muscularis mucosae bei uns?

Die Längsmuskulatur im Proventrikulus sehe ich jetzt auch.
Nun könnte es Zeit für eine weitere Differenzierung der Zellen sein, andere
Färbungen, Histochemie. Vielleicht kann Ronald etwas dazu sagen.

@Ronald
Ja, an die Sekretion glaube ich auch, obwohl nichts PAS positiv ist.
Wir haben es ja mit einem einschichtigen Darmepithel mit deutlichem
Mikrovillibesatz zu tun. Eigentlich sind resorbierendes Darmepithel
und secernierendes Drüsenepithel ja getrennt beim Menschen, oder???
Aber vielleicht ist das bei anderen Species ja anders, das ist ja gerade
das spannende. Hast du Ideen zu anderen Färbungen?

Die Klemme auf Bild 18 hat mich viele Nerven und viel Geld gekostet.
Als ich mein 2050 in England gekauft hatte und endlich der Transport
geklappt hatte war die Enttäuschung groß, denn es war ein Halter für
Paraffinkassetten dran. Damit kann man für Technovit nichts anfangen
und ich hatte das Mikrotom speziell für Technovit gekauft.
Vielleicht hätte man den Halter abflexen können und so einen ,,Schraubstock-
halter" anschweißen können, ich weis es nicht. Die Halter sind bei den meisten
Mikrotomen an einer speziell gestalteten Stange angebracht, und das wechselt
natürlich von Serie zu Serie, die wollen ja verkaufen.
Ich kenne in Deutschland nur zwei Firmen die so etwas noch haben könnten.

Histoserve von Herrn Jakobi
https://www.histoserve.de/leistungen/
und

TechnoMed, Herr Busse hat das Geschäft offiziell abgegeben, arbeitet aber weiter.
https://www.techno-med-world.com/

Histoserve hat mir das Teil dann für 400E verkauft.

Den V-Keil, den Glasmesserhalter und das Mikroskop habe ich dann bei TechnoMed
bekommen. Ruf doch mal da an.

viele Grüße, Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

das letzte Bild ist so fantastisch gut, dass Du davon unbedingt noch mehr zeigen musst. Und auch Dein Fragezeichen bzw. die Nr. 3 in Deinem letzten Bild schreit danach, dass Du noch "nacharbeiten" musst: Ein Längsschnitt würde Deine Frage klären. Dabei ließe sich auch zeigen, an welcher Stelle des Darms Du bist.

Ich habe ganz auf die Schnelle ein schlechtes Photo von einem Deiner Präparate geschossen, dass mich zu einer Vermutung führt:



Bei Grünpfeilen siehst Du einen zottigen Aufbau der Darmwand. Bei dem Rotpfeil hingegen zeigt sich der Darmteil, den Du in Deinem letzten Bild zeigst. Meine Vermutung ist, dass Du im Bereich der Valvula pylorica bist, also an der Grenze zwischen Mittel- und Hinterdarm, der dann auch einen ganz anderen Epithelaufbau und eine verstärkende Muskulatur erklären könnte. Auffällig sind die überaus zahlreichen Regenerationszellen, die sich ringartig um das Darmlumen schließen, was ebenfalls für diese Stelle sprechen könnte. (Imaginalring?)

Was die Färbungen angeht: Vielleicht versuchst Du einmal, eines Deiner Tierchen mit Bromphenolblau zu füttern und dann seinen Hinterdarm zu sezieren. Die Färbung würde Aufschluss über den pH Wert verschiedener Darmteile geben.

Schöne Grüße

Jürgen

[Ronald Schulte]

...das letzte Bild ist so fantastisch gut...

Ja, so wie Jürgen schon geschrieben hat ist dein letztes Bild ein echter Knaller, und ich denke, deine Präparation und Fotoqualität hat sich die letzten Jahre enorm verbessert. Wirklich erstklassig.
Auf deine Frage nach neuen Färbungen kann ich mitteilen, dass ich gerade an einer Färbung auf der Basis von Azur II und Fuchsine basisch arbeite. Ich fand sie in einem Artikel, der mich wegen des großen Kontrastes zwischen Azur und Fuchsine ansprach. Der entscheidende Punkt bei dieser Färbung ist die hohe Temperatur, bei der die Färbung erfolgt. Die Farbstoffe werden bei Hundert Grad Celsius angeboten. Die Farbstoffe werden zusammen angeboten.

Eine weitere interessante Färbung, ist ein einfarbige Hämatoxylin Färbung. Dies ist besonders für Hoden interessant. In Technovit und LR WHite farbe ich ein 0,7µm Schnitt zwischen 15 und 20 Minuten. Blauwen in Kalkreiches Wasser oder ein Tropfen Ammoniak zusetzen.

Grüße Ronald

[Ronald Schulte]

Ralf,

In Technovit Funktioniert die Berliner Blau Färbung auch sehr gut aber das ist ja nur eine sehr Spezifische Eisennachweis Reaktion.
Ein PAS Reaktion geht auch prima und Alkalische Fosfatase musste Funktionieren. Weiter ist es in Kunststoffe bei lange nicht so interessant wie in Paraffin Schnitte. Bei Kunststoffe geht es um Detail!

LG Ronald