Die Peritrophische Membran (Insektenhistologie)

[Ralf Feller]

Liebe Kollegen,
heute möchte ich etwas mehr zur Insektenhistologie zeigen.
Nachdem Jürgen Harst gerade Flagellaten im ektoperitropischen Raum von Insekten
nachgewiesen hat, möchte ich auch ein paar Gedanken zur peritrophischen Membran
beisteuern und hoffe auf rege Diskussion.

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39196.0

Eine Besonderheit im Mitteldarm vieler Arthropoden ist die peritrophische Membran (PM).
Sie findet sich bei vielen Insekten einigen Krebstieren, aber auch bei Stummelfüßern;
sie fehlen jedoch bei allen Spinnentieren, Würmern und Bärtierchen.
Sie umschließt den Nahrungsbrei wie ein Condom und wird entweder am Beginn des
Mitteldarms (Cardia) oder vom gesamten Mitteldarm gebildet. Dabei ist sie für Nährstoffe
durchgängig, schützt aber die Darmzellen vor mechanischer Beschädigung und der
Infektion durch Krankheitserreger. Besonders die Schutzwirkung vor Infekten durch
Viren (z.B. Dengue), Bakterien (z.B. Rickettsien) und Parasiten (Malariaplasmodien,
Tryphanosomen der Schlafkrankheit, Leishmanien u.v.m) macht diese Membran
bei den blutsaugenden Insekten so interessant denn die Membran muss überwunden
werden um das Insekt zu infizieren. Erst dann kann eine Infektion an Menschen und
Tiere weiter gegeben werden. Wie dies funktioniert ist noch nicht für alle Insekten
und Erreger abschließend geklärt. Es sind aber Infektionsmechanismen wie Hemmung
der Membranbildung und Durchdringung beschrieben worden.
Männliche Stechmücken die kein Blut saugen bilden übrigens keine PM.

Es werden zwei Typen von PM unterschieden. Die Bildung vom Typ I tritt normalerweise
als Reaktion auf die Fütterung auf, kann aber auch kontinuierlich erzeugt werden.
Bei der Bildung als Reaktion auf die Fütterung wird eine einzelne Matrix vom
Mitteldarmepithel ausgeschieden. Diese Matrix umgibt den Nahrungsbolus und wird
später zusammen mit unerwünschten Materialien, die nach der Verdauung im
Nahrungsbolus vorhanden sind, ausgeschieden.

Typ - II - einer Peritrophische Membran wird nur in einigen Familien wie
Diptera (Fliegen, Mücken) , Dermaptera , Embioptera und Lepidoptera gefunden.
Bei der Typ II-Bildung wird die peritrophe Matrix von einer speziellen Gruppe von
Zellen produziert, die auf dem Proventriculus des vorderen Mitteldarms vorhanden
sind. Die Bildung vom Typ II ist ein kontinuierlicher Prozess, der unabhängig von der
Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nahrungsbolus durchgeführt wird. Somit wird
die peritrophische Matrix als ungebrochene, konzentrische, "hülsenartige" Struktur
sekretiert. Obwohl die peritrophische Matrix kontinuierlich sekretiert wird, erhöht das
Vorhandensein eines Nahrungsbolus die Produktionsrate signifikant. Darüber hinaus
stimuliert das Vorhandensein eines Nahrungsbolus die Produktion mehrerer Matrizen,
die den Bolus umgeben. Nach der Sekretion einer primären peritrophischen Matrix
werden nachfolgende Matrizen unter der ersten Matrix sekretiert, um eine geschichtete
peritrophische Hülle zu erzeugen.

Ich versuche einmal am Beispiel einer Stechmückenlarve (Culex pipins) im letzten
Stadium ein solches Membransystem aufzuzeigen.
Den Aufbau eines Insektendarms hatte ich Anfang des Jahres schon mal gezeigt.
Hier war allerdings keine peritrophische Membran zu sehen, denn die Tiere
hatten gehungert.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37058.0

Abb. 1 ist die schematische Darstellung des Proventriculus, wie er in der sagittalen Ebene
zu sehen ist. Der Proventriculus ist ein Übergangsbereich zwischen dem Vorderdarm (lila),
bestehend aus der Speiseröhre (O) und Kropf (C) und dem Mitteldarm. Die PM (orange)
stammt aus einer Reihe von spezialisierten Epithelzellen. (Dank an Jürgen Harst)

Abb.1

Aus: Trypanosoma brucei colonises the tsetse gut via an immature peritrophic matrix
in the proventriculus A. Prior,  View ORCID ProfileÁlvaro Acosta-Serrano
doi: https://doi.org/10.1101/513689

Abb. 2 zeigt die Culexlarve mit der Schnittführung,
Fixierung in Formaldehyd / Glutaraldehyd in Phosphatpuffer,
Einbettung in LR White wie in dem Beitrag über die Heuschrecke beschrieben.

Abb. 2


Die Abb. 3 bis 12 zeigen die Schnitte in chronologischer Abfolge,
gefärbt mit Toluidiblau oder Acridinorange mit Blauanregung.

Abb. 3 Proventriculus in seiner Lage,
Abb. 4 ist eine Vergößerung des Folgeschnittes (1µ) in Fluoreszenz.

Abb. 3


Abb. 4


In Abb. 4 bilden die Zellen des Mitteldarms den äußeren Ring,
darin fingerförmig eingestülpt der Vorderdarm mit Kropf und Cardia.
Zentral ist die peritrophische Membran zu erkennen,
nach außen folgend eine Zellschicht die wohl die Membran bildet,
weiter außen Anteile des eingestülpten Vorderdarms
und darauf folgend eine weitere Membran die sich wie die PM
anfärbt (PM2?). Ich nehme an, das sich diese Membran nach dem
Ende der Vorderdarminvagination mit der PM vereinigt.
In diesem Bereich finden sich keine Bakterien!

Die Folgeschnitte in Abb. 5 zeigen nun wie sich eine sclerotisierte
cuticuläre Struktur (dunkler Ring) gebildet hat, vergrößert in Abb. 6.
Leider habe ich von diesem Bereich keine Fluoreszenzaufnahmen gemacht.
G1 bis G6 sind die gastric caecae, seitliche Aussackungen zur Vergrößerung
des Verdauungsraums. Hier lassen sich nun zahlreiche Bakterien nachweisen.

Abb. 5


Abb. 6


Von Abb. 7 bis 12 ist die PM nun sehr dünn und einschichtig.
Die Mikrovillihöhe (grün in der Fluoreszenz) ist dabei in den
gastric caecae (GC) deutlich höher als im zentralen Mitteldarm.
Zum Teil sehe ich in den GC gar keine PM und es finden sich
Bakterien, die direkt den Mikrovilli aufsitzen, während der
ektoperitropische Raum des Mitteldarms weitgehend bakterienleer
ist. Im weiteren Verlauf des Mitteldarms dürfte sich aber die Struktur
des Insektenmitteldarms weiter ändern, auch die Mikrovilli sollten wieder
an Höhe zunehmen, s. hier, Schnitt weiter caudal, denke ich.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29109.0

Abb. 7


Abb. 8


Abb. 9


Abb. 10


Abb. 11


Abb. 12


Die Acridinorange-Färbung ist nun eigentlich eine Färbung für Bakterien,
sie weist je nach Konzentration und pH-Wert DNA (grün) und RNA (orange)
nach. Aber wie sieht das bei chitinhaltigen ganzen Organismen aus?
Preitrophische Membran und Mikrovilli erscheinen grün, sind aber sicher nicht
DNA-haltig, auch das rot leuchtende Exoskelett scheint mir keine RNA-Quelle zu
sein. Was färbt sich also wie an? Membransysteme scheint man jedenfalls damit
gut sichtbar machen zu können. Was diese Färbung in der Protozoologie zeigen
kann haben wir ja schon oft von Thilo Bauer gesehen. Auch hier hoffe ich sehr auf Ideen.

Einen schönen 3ten Advent,
LG Ralf

[Alfons Renz]

Lieber Ralph,

Ein (für mich!) hochinteressantes Thema und wunderschöne Schnitte!

Zunächst möchte ich zur Diskussion stellen: Soll man sagen - peritrophe oder peritrophische Membran? Ich tendiere zu Ersterem. Nicht nur, weil es das kürzere und sprachlich prägnantere Adjektiv ist, sondern auch, weil es genau deren Eigenschaft beschreibt. Die Membran umgibt die Nahrung, und es gibt keine andere Membran, mit welcher sie konkurrieren würde. Vgl. Französische vs. englische Sprache oder einfacher: Französisch und Englisch. Würde man die p. Membran als eigene Struktur betrachten, könnte man auch sagen: die Peritrophis.

Aber da bewege ich mich zugegebenermaßen auf fremden und unsicheren Grund. Vielleicht kann ein Sprachwissenschaftler/in helfen? Folgt man dem 'allgemeinen Sprachgebrauch' und Wikipedia, so liest man häufiger 'peritrophische Membran'. Mir sträuben sich da immer ein bisschen die Nackenhaare.

Leichter ist es bei den Blindsäcken des Mitteldarms: Ein Einzelner solcher Sack heisst Caecum, die Vielzahl Caeca.

Klaren Widerspruch gibt es nur bei der Feststellung: "Sie (die p. Membran) umschließt den Nahrungsbrei wie ein Condom" Ein Solches hat zweckmäßigerweise nur eine Öffnung, eine p. Membran zwei: Vorne und hinten!

Alles sonst von Dir Gesagte ist recht und richtig - aber, und genau da setzt auch Deine Frage an, wo sieht man dies Alles in den Schnitten?

Die Interpretation morphologischer Strukturen fällt viel leichter, wenn man vorab schon die Schnittebene so legt, dass die Beantwortung möglichst leicht fällt. Ein Sagittal-Schnitt wäre hier optimal. Man würde dann den ektodermalen Vorderdarm (Pharynx, Oesophagus) mit chitinöser Auskleidung erkennen, nachfolgend den Kropf und das Proventriculum oder Diverticulum, je nach Ausbildung als Blindsack oder Erweiterung,  die Cardia (Magen) - alles immer noch ektodermal -, und dann den entodermalen Mitteldarm (=> Zellen mit Microvilli), der dann in das widerum ektodermale Rektum übergeht.

Dieser grundsätzliche Aufbau ist vielfältig modifiziert und unterscheidet sich zudem im Larval- und Imaginal-Stadium, was die Benennung (Homologie) ziemlich erschwert. Ich bin da kein Spezialist, versuche aber - aus didaktischen Gesichtspunkten - eine logische Struktur hineinzubringen. Das kann eine spannende Diskussion werden!

Die p. Membran hat sicherlich eine Schutzfunktion, stellt jedoch für die spezifischen Parasiten offenbar keine große Hürde dar. Die Ookineten der Plasmodien durchdringen sie mühelos mit Hilfe ihrer Chitinase. Hemmt man diese, so gelingt die Penetration nicht. Umgekehrt aber führt die Hemmung der Bildung der p. Membran nicht zu einer höheren Befallsrate des Mitteldarms. Dazu kann ich gerne Bilder von der Entwicklung von Plasmodien in Anopheles zeigen, muss diese jedoch erst noch machen...

Ein bei den Studenten beliebtes Experiment zeigt die Festigkeit der p. Membran und vor allem die Schnelligkeit der Passage des Nahrungsbreis durch den Darm: Wir füttern dazu die im Wasser filtrierenden Larven von Kriebelmücken erst für jeweils 20 Minuten mit schwarzer Kohle, dann mit roten und gelber Kreide. Danach trennt man vorsichtig Thorax und Abdomen vom Kopf und kann den Darminhalt als Ganzes herausziehen. Die p. Membran umgibt den Brei wie eine durchsichtige Plastikhülle.

Die Farbgebung ist der Euphorie des damaligen 'Sommerfußballmärchens' geschuldet: Als 'Simuliidenorakel' sollte der Ausgang des Experiments den Erfolg der Nationalmannschaft prophezeien. Andere Farbgebungen sind natürlich problemlos möglich. Aber damals hat es ganz gut funktioniert!

Einen schönen 3. Advent,

Alfons

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

ein toller Beitrag, aufwändig erstellt! Ein wenig Probleme habe ich mit den Bezeichnungen bei den Bildern 4  und 6. Ich denke, da hast Du ziemlich genau den Teil getroffen, der in Abb. 1 dargestellt ist. Dann aber müsste doch die an dieser Stelle immer wieder neu gebildete peritrophe Membran genau das sein was Du mit PM2  bezeichnet hast.  Dort, wo Du die Bezeichnungen "peritropische Membran" angebracht hast, wäre hingegen die Einstülpung des Vorderdarms mit seinem Epithel zu sehen bzw der Verschluss oder das Ventil, das den Rückstrom des Nahrungsbreis in den Vorderdarm verhindert. Aber das ist nur eine Vermutung meinerseits, hier wäre in der Tat ein Sagittalschnitt toll (da kommt interessante Arbeit auf Dich zu!)

Lieber Alfons, Du regst eine Diskussion über die korrekte Bezeichnung der den Nahrungsinhalt des Mitteldarms umhüllenden Membran an. Ich hatte bisher noch nie darüber nachgedacht, und war bisher dem wohl überwiegenden Sprachgebrauch gefolgt: Peritrophische Membran. Ich vermute, dass dieser Sprachgebrauch auf eine  nicht gut bedachte Eindeutschung des englischen Begriffs peritrophic membrane zurückgeht. Trophisch würde ja wohl bedeuten: Die Nahrung betreffend. Dann würde das peri- : Um herum nicht passen. Also peritrophe Membran, peri trophe Um die Nahrung herum. Danke für den Hinweis!

Zum "Condom": Ich denke, Ralf will mit dieser Bezeichnung ausdrücken, dass die peritrophe Membran oben sehr wohl abgeschlossen ist: Nicht gegen den Vorderdarm natürlich, aber gegen das Mitteldarmepithel. Weshalb ich mich ja in meinem Beitrag https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=39196.0 gefragt hatte, wie die Flagellaten in den ektoperitrophen  Raum gelangen. An der Cardia können sie nicht, dachte ich, und über den Umweg am hinteren offenen Ende der peritrophen Membranund dann wieder zurück schien mir ebenso unwahrscheinlich. Und dann stieß ich auf den schönen Artikel, den Ralf im Beitrag auch zitiert hat und aus dem das schematische Bild stammt: https://doi.org/10.1101/513689

Herzliche Grüße

Jürgen

[bewie]

Hallo Ralph,

toller Beitrag, da kann ich nur staunen, weil ich von Insektenanatomie nix verstehe.
Aber was das Acridinorange betrifft: Ich kann mich dunkel erinneren, dass es auch extrazelluläre saure Gewebeteile wie beispielsweise Polysaccharide anfärbt. Ist das vielleicht eine Erklärung? Insekten bauen meines Wissens doch viele ihrer Bestandteile aus Polysacchariden.

LG Bernhard

[Ralf Feller]

Lieber Alfons,

Was den Sprachgebrauch preitrophisch / peritroph anlangt,
da gebe ich Dir völlig Recht, ich habe mich da auch von dem
mehrheitlichen Gebrauch im Netz leiten lassen.
Ja das mit der Prophezeiung hat ja gut funktioniert, könnt ihr
das nicht auch für die Wirksamkeit der Covidimpfstoffe machen,
oder brauchen wir da einen Kraken?

Habt ihr eigentlich Tiere in Kultur?
Ich hatte vor 11 Jahren eine gut laufende Zucht von Culex pipiens
molestus.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=2156.0
In diesem Jahr ist mir das nicht gelungen. Ich hatte C. pipiens
aus der Gartentonne versucht in Kultur zu bringen, doch konnte
ich die Weibchen nicht zum stechen und zur Vermehrung bringen.
Jürgen meinte, dass die Größe der Box zur Paarung nicht ausreichte.

Bilder von der Entwicklung von Plasmodien in Anopheles fände ich
klasse! Auch das ist wohl ohne eine Kultur schwierig?


Lieber Jürgen,
ich habe auch einige Probleme bei der Interpretation,
aber die Bilder 4 und 6 sind doch sehr verschieden, Bild 4 ist weiter
cranial als Bild 6. Auf dem Weg von Schnitt 4 nach Schnitt 6 hat
sich diese dichte cuticulare Struktur eingefügt, die in  3 und 4 absolut
nicht vorhanden ist.
Du hast völlig recht, PM2 sollte die sekretierte PM sein.
Nun sind aber auf den Bildern 3 bis 6 eindeutig zwei Membranen
zu sehen, die nach dem Verschwinden der Invagination, Bild 7,
verschwunden sind, dann ist nur noch eine Membran da.
Daher hatte ich vermutet, das es zu einer Verschmelzung der
Membranen gekommen sein könnte. In der Literatur wird auch
schon einmal von zwei Blättern beim Typ-2 der PM gesprochen,
die sich nach Fixierung aber nicht mehr darstellen ließen.
Für was hältst Du denn die grün leuchtende Innenauskleidung
in Abb. 4?


Lieber Bernhard,
danke für Dein Lob!
Da ist aber auch etwas, was Du mir mit deiner langjährigen
Erfahrung in der Fotographie erklären kannst.

Ich verwende für die Fluoreszenzaufnahmen immer noch ein
Zeiss Standard mit dem Auflichtkondensor IV und eine an den
Trino über ein Kpl Okular adaptierte CoolPix 990.
Die Aufnahmen sind so wie ich sie im Okular sehe.
Für Durchlichtaufnahmen habe ich eine Eos 700d über Pancake
adaptiert. Die Aufnahmen gehen direkt auf den PC, was ich
bei der CP vermisse.
Nun habe ich diese Adaption auf das Fluoreszenmikroskop
gesetzt und sehe ein schönes Bild auf dem PC. Löse ich nun
aus, so ist die Aufnahme völlig überstrahlt. Harald Maage hat
mir nun geraten, nach dem Scharfstellen die Belichtungszeit
zu reduzieren, dann wird der LiveView schwarz, die Aufnahme
gelingt aber, ABER das Farbbild ist ein anderes, die roten
Farbtöne werden als gelb wiedergegeben.
Mache ich da was falsch mit der Eos?

viele Advendsgrüße, Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

ich hoffe, ich darf in Deinem so schönen Beitrag zur Diskussion auch ein paar Bildchen aus meinem Bilderkasten beitragen. Das nachfolgende Bild ist ein Schnitt durch die Imago einer Mücke, keine blutsaugende, sondern eine Stelzmücke.

Wir sind im Thorax, der Kopf ist oben zu denken.SpD ist eine Speicheldrüse, die sich bereits im Thorax befindet. Oe ist ein Anschnitt des Oesophagus, P der Proventriculus oder die Cardia, MD der mit gutem Mikrovillibesatz ausgestattete Mitteldarm, K der entlang des Mitteldarms verlaufende Kropf.



Wenn bei dem Buchstaben P quer geschnitten worden wäre, bekäme man eine vergleichbare Situation, wie auf Deinen Photos 4-6. Die Länge der Einstülpung des Vorderdarms in den Mitteldarm ist doch ziemlich beträchtlich.

Etwas näher herangezoomt sieht es so aus:



LMK und RMK Muskulatur des Kropfes
MP Muskulatur des Proventrikulus
MV Mikrovilli

Und an einer Schnittebene höher sieht man bereits schön die Ringmuskulatur des Proventriculus, die im vorigen Bild noch quer geschnitten war:



An den Photos kann man auch ganz gut erkennen, wie faltig die Einstülpung in den Mitteldarm und wie faltig der Mitteldarm selbst verlaufen.

Meine Mücke besitzt keine peritrophe Membran, aber ich denke, die Situation ist vergleichbar.

Schöne Grüße

Jürgen

[bewie]

Hallo Ralf,

vielen Dank, aber da überschätzt Du mich. Außerdem hast Du hast ein Equipment, mit dem ich mich nicht auskenne. Ich verwende nur eine kleine Lumix G5 und lasse sie das RAW-Format auf der Speicherkarte ablegen.

Das mit der Belichtungsreduktion ist klar. Weil ich keine Punkt- sondern Integralmessung eingestellt habe, mache ich das auch so; nicht nur bei Fluoreszenz, sondern immer, wenn der überwiegende Teil des Bildes dunkel ist und bleiben soll, also auch bei Dunkelfeld oder dunkel gestelltem DIC. Bei mir bleiben die Farben aber erhalten; warum das bei Dir anders ist, verstehe ich nicht. Vielleicht liegt es daran, dass der Sensor pro Pixel einen roten, einen blauen, aber zwei grüne Sensorpunkte hat und bei heruntergeregelter Belichtung das Rotsignal schächelt und das Grünsignal dominiert? Was landet bei dir auf dem Computer, das RAW-Format oder ein fertiges Bild? Bei fertigen Bildern kanns auch am Algorithmus der Kamera liegen, der mit großen Dunkelanteilen vielleicht Schwierigkeiten hat. Nach meiner Erfahrung werden solche merkwürdigen Ergebnisse meist durch die Algorithmen verursacht, wobei die Kamaras aber auch schon beim Erstellen des RAW-Formats die Messwerte umrechnen. Aber was dein konkretes Problem betrifft, ist das jetzt alles Spekulation.

Hast Du mal versucht, Aufnahmen ohne Verbindung zum Rechner und nur mit dem Bildschirm bzw. Sucher der Kamera zu machen? Bei mir habe ich auch bei stark reduzierter Belichtung letztlich ziemlich genau das, was ich auch auf dem Kamerabildschirm sehe.

LG
Bernhard

[Ralf Feller]

Lieber Jürgen,

hättest Du die Bilder nicht selbst eingestellt,
hätte ich Dich darum gebeten.

Du hast Recht, der in Deinem ersten Bild mit P gekennzeichnete
Bereich entspricht meiner Schnittführung in meinem Bild 4.

Ja aber es sind doch in meinem Bild 4 zwei Membranen zu sehen,
PM und PM2?
Wenn ich nun mit Deinem Schnitt vergleiche, so sollte das bedeuten
das die Membran schon vom Proventriculus/Cardia gebildet wird.
Das könnte erklären warum ich zwei Membranen sehe, getrennt durch
die Umschlagfalte.

Mein Bild 6 zeigt einen Schnitt weiter caudal, also wenige µm unter
Deinem P, sollte das denn eine sclerotisierte Lippe der Cardia sein?



Lieber Bernhard,

danke für die Erläuterungen!
Ich bin nur ein einfacher ,,Knipser" und habe noch nie mit dem
RAW-Format gearbeitet. Bei mir werden einfach nur jpgs abgespeichet.
Ohne direkten PC-Anschluss zu fotografieren werde ich mal versuchen.
So mache ich es ja auch bei meiner 20jahre alten Coolpix.
Hier entspricht das gespeicherte Bild vollständig dem Bild das ich auf
meinem Fokussiermonitor sehe.


@Jürgen,
wie ist denn das bei Deinen Fluoreszenzaufnahmen?

LG Ralf

[Jürgen H.]

Lieber Ralf,

ich bin mir nicht sicher: Aber ich meine, in Bild 6 einen großen Schrumpfungsspalt zu sehen zwischen dem, was Du als Bildungszellen bezeichnet hast und dem, was Du peritrophische Membran genannt hast. Und wenn ich mir das Fluobild 4 ansehe, scheint es mir, dass sich unter dem grünen Häutchen ,,peritrophische Membran" kein freier ektoperitropher Raum befindet, sondern eine leicht faserig erscheinende Gewebestruktur. Und daher meine ich, dass es sich nicht um eine peritrophe Membran handelt, sondern um die innere Auskleidung des Oesophagus, der sich dort in den Mitteldarm hineinstülpt.

Du kommst nicht um einen schönen aussagekräftigen Längsschnitt herum. Dann würden wir die Bildungszellen der Membran identifizieren können und würden auch sehen, ob das fluogrünleuchtende Häutchen ,,peritrophische Membran" sich wirklich als solche im Mitteldarm fortsetzt.

AO ,,gefärbte"Fluoaufnahmen von einem LR Whiteschnitt kommen noch irgendwann, im Moment schneide ich einen Technovitblock Hoden, und Technovit in AO hat eine kräftige Eigenfluoreszenz, da wird das ganze Bildhintergrund hell.

Schöne Grüße

Jürgen