Färbungen für Zellteilung (Unna-Pappenheim vs. Kernechtrot-Anilinblau-Orange)

[Alf]

Die Färbung von Mitosefiguren funktioniert sehr gut mit einfachen Färbeprotokollen (Fuchsin, Methylenblau, Hämatoxylin). Mit den beiden im Anschluss beschriebenen (aufwändigeren) Färbungen erhält man noch etwas farbintensivere Ergebnisse. Als Testobjekte dienten Wurzelspitzen und die Ovarien einer Schwertlilie.

A) Unna-Pappenheim-Färbung (Methylgrün-Pyronin):
Durch Kombination von Methylgrün und Pyronin, sollten sich ruhende Zellkerne (Interphasekerne) grün, Mitosefiguren bläulich und Nucleoli (kleine Kernkörperchen die aus RNA bestehen9, rot anfärben. Das Cytoplasma der Zelle sollte ebenfalls zart rot/rosa gefärbt werden.

Herstellung:

• zuerst muss das Methylgrün, welches herstellungsbedingt so gut wie immer mit Kristallviolett verunreinigt ist, vollständig von diesem befreit werden. Dazu legt man in einem Schnappdeckelglas 40 mg Methylgrün und 1,75 ml Wasser vor. Man gibt einen kleinen Magnetrührfisch hinzu und löst das gesamte Methylgrün. Die folgenden Schritte sollten im Freien oder in einem Abzug durchgeführt werden. Im Anschluss werden 5 ml Dichlormethan hinzugegossen und stark gerührt. Das Kristallviolett enthaltende Dichlormethan setzt sich am Boden ab und wird abpipettiert. Die Extraktion wird insgesamt 5 mal wiederholt sodass das Dichlormethan völlig farblos ist und das gesamte Kristallviolett entfernt wurde. Im Anschluss werden die 1,75 ml Methylgrün Lösung für kurze Zeit auf eine ca. 80°C warme Herdplatte gestellt, sodass kleinste restmengen Dichlormethan verdunsten. Die gesammelten Dichlormethan Extrakte werden unbedingt als halogenhältige Lösungsmittelabfälle entsorgt.
• In einem zweiten Schnappdeckelglas werden 50 mg Pyronin G vorgelegt und in 1 ml Wasser gelöst. Die Pyronin G Lösung kann zur gereinigten Methylgrün Lösung gegeben werden.
• Die erhaltene Farbstofflösung wird 30 ml Wasser verdünnt und ist jetzt einsatzbereit.

Durchführung:
Die entparaffinierten Schnitte werden für 15 Minuten in die fertige Färbelösung eingestellt und im Anschluss mit Isopropanol gewaschen und über n-Butanol und Xylol entwässert und eingedeckt.

Ergebnisse:
Die Färbung ist so gelungen wie sie es sollte. Das Kernchromatin färbt sich je nach Kondensationsgrad grün (unkondensiert in der Interphase) - blaugrün/blau (kondensierte Chromosomen während der Kernteilung). Man darf aber nicht zu lange Färben, da es sonst durch eine Überfärbung zu einer einheitlichen Blaufärbung aller Kerne kommt und die Nucleoli ebenfalls nicht schön differenziert dargestellt werden.


Dünnschichtchromatographie; Methylgrün Farbstoff in Bande 7 - deutlich zu erkennender Kristallviolett Spot (Kristallviolett 1-3).


Während der ersten Extraktion mit Dichlormethan; untere violette Phase ist das abgesetzte Dichlormethan.


Fertige Farbstofflösung links - rechts gesammelte Dichlormethan Extrakte.


Ausschnitt aus dem Ovar einer Schwertlilie - blaue Mitosestadien in einem schwarzen Kreis; restliche Kerne deutlich grün mit roten Nucleoli.


Ausschnitt aus dem Rand eines sich entwicklenden Blattes - grüne Interphasekerne und blaue Metaphase Figur.


B) Kernechtrot-Anilinblau-Orange:
Die Hertsellung und Durchführung dieser Färbung ist bei Aeisner (http://www.aeisner.de/methoden/farb34.html) bestens beschrieben und wird genauso gemacht. Das Differenzieren in Wolframatophosphorsäure (die auch durch Molybdatophosphorsäure ersetzt werden kann) wird unter mikroskopischer Kontrolle so lange durchgeführt, bis nur die Zellkerne leuchtend rot gefärbt bleiben. Das Differenzieren am Ende mit 96% Ethanol ist sehr unkritisch und benötigt etwas zeit. Das Anilinblau überfärbt ziemlich stark und wird nur langsam durch das Ethanol entfernt. Man kann den Schnitt mehrmals mit Ethanol überschichten und auf eine 50°C warme Heizplatte legen um den Vorgang zu beschleunigen. Am besten wird das unter mikroskopischer Kontrolle durchgeführt bis die Zellkerne leuchtend rot erscheinen.

Ergebnisse:
Schöne scharfe Kernfärbung, Interphasekerne werden dunkelroter gefärbt, während Mitosefiguren knallrot hervortreten. Die Nucleoli werden ebenfalls blau gefärbt und sind gut vom Zellkern (Nucleus) abzugrenzen. Das Cytoplasma und die Zellwände werden blau gefärbt.


Übersichtsaufnahme; blaue Zellwände und blau/graues Cytoplasma; Interphasekerne rot; Mitosefiguren deutlich röter gefärbt; Nucleoli treten als blaue Punkte in den Zellkernen hervor.


Detailaufnahme


Detailaufnahme


Conclusio:
beide Färbungen liefern wunderbare Ergebnisse. Die Unna-Pappenheim Färbung ist aber wesentlich aufwändiger auf Grund der notwendigen Reinigung (außer es gibt vielleicht reines Methylenblau zu kaufen, aber selbst in den neuen Herstellungsvorschriften von Merck steht, dass eine Reinigung mit Trichlormethan (Chloroform) notwendig ist), die mit nicht harmlosen Lösungsmittel durchgeführt wird. Die Unna-Pappenheim Färbung ist durch die Farben Blau, Grün und Rot dafür etwas vielfärbiger. Aber auch bei der Kernechtrot-Anilinblau-Orange G Färbung kann man sehr schön zwischen Interphasekernen und Kernteilungsstadien unterscheiden. Vor allem erspart man sich eine mühsame Aufreinigung des Methylgrün. Andererseits muss man die Aufreinigung ja nur einmal durchführen um eine beliebige Menge Farbstofflösung herzustellen und so häufig wird man diese Färbung ohnehin nicht durchführen.

LG