DIY Auflichtfluoreszenz, verschiedene Filter, LED's

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Mikroskopische Fluoreszezaufnahmen üben einen besonderen Reiz auf den Betrachter aus. Die leuchtenden Farben vor schwarzem Hintergrund, verbunden mit dem Informationsgehalt den dieses Beleuchtungsverfahren zu bieten hat, sind meiner Meinung nach sehr reizvoll. Bei vielen Amateur kommt daher früher oder später der Wunsch auf sein Mikroskop dahingehend aufzurüsten.
Zumindest war das bei mir so.
Schnell bemerkt man dann, das dafür ganz bestimmte Filterkombinationen und Fluoreszenzkondensatoren nötig sind. Diese Filterwürfel sind, auch gebraucht, oft noch sehr kostspielig, müssen genau zum Anwendungszweck passen und sind zu guterletzt auch noch anfällig für Alterung/Schäden.
Klar kann man sich auch ein komplettes neues Fluoreszensmikroskop kaufen, aber da bleibt dann sowohl der Bastelspaß, als auch eine Menge Geld auf der Strecke.
Im Folgenden möchte ich hier meine Lösung vorstellen die mit einem gewöhnlichen Auflichtkondensor und einigen relativ einfach zu beschaffenden Filtern zu realisieren ist. Einige Testaufnahmen sollen dabei zeigen welchen jeweiligen Einfluss die einzelnen Komponenten dabei auf die Bildqualität haben.
Ich hoffe dem ein oder anderen so bei seinem Projekt von Nutzen zu sein.
Doch nun erstmal zum eigentlichen Aufbau, einem Zeiss WL mit Auflichttubus:
(Nicht der schönste Hintergrund, ich weiß)

Vorteil bei diesem Konstrukt ist, das sich sowohl die LED als auch der Farbteiler sowie die Anregungs und Emissionsfilter getrennt voneinander einfach austauschen lassen.
Perfekt zum pröbeln!

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Natürlich funktionieren auch einfachere Varianten des Auflichkondensors:
Hauptsache es läßt sich auf Beleuchtungsseite ein Filter zwischen Lichtquelle und Umlenkspiegel einbringen.
Auf der Beobachtungsseite braucht man natürlich dann einen passenden Emissionsfilter.
In dieser Testreihe für Blauanregung wurde bei allen Aufnahmen ein gelber Farbglasfilter mit 530nm Langpass angewendet.
(Hier funktionieren übrigens auch geeignete Gelbfilter aus der Analogfotografie sehr gut.)

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Und jetzt zur eigentlich Testreihe.
Alle Aufnahmen wurden am oben gezeigten Mikroskop mit einer Sony a6500 angefertigt. Alle 3Watt LED's bei allen Aufnahmen mit gleicher Leistung versorgt.
Belichtungszeit bei allen Aufnahmen1/15sec, ISO 400
Fragen: Wie wirken sich verschiedene Anregungsfilter auf die Abbildung aus? Kann man bei geeigneter LED vielleicht sogar ganz auf einen Anregungsfilter verzichten? Und was erreicht man über Bildbearbeitung?
Zuerst einmal ganz ohne Anregungsfilter:
Hm, naja sieht eher bescheiden aus, obwohl es sich um eine schmalbandige Qualitäts LED handelt. Aber selbst ein kleiner Anteil an langwelligem (grünem) Licht, reicht hier bereits aus, um die Autofluoreszenz des Chlorophylls im Moosblatt komplett zu überstrahlen.

Jetzt mal mit einem alten Farbglasfilter:
OK, mit einem 4mm dicken Blaufilter aus Farbglas (BG12 von Zeiss) sieht das schon besser aus. Allerdings ist das Bild (bei gleicher Belichtungszeit) dann auch zappenduster.

Jetzt das ganze mit einem Metallinterferenzfilter (KP490nm von Zeiss Jena):
Die deutlich bessere Lichtausbeute des Interferenzfilters ist deutlich zu sehen, und führt nun auch erstmalig zu so etwas wie einem Bild.

Wie schaut es nun mit der Möglichkeit aus das Bild nachträglich zu bearbeiten, indem man den unerwünschten Anteil im Farbkanal einfach herausrechnet:
OK, das funktioniert aber natürlich nur bei roter Fluoreszenz. Grüne Emissionen wie beispielsweise bei Acridinorangefärbung sind dann aber auch futsch...
Schauen wir als nächstes ob sich nicht durch die Wahl einer anderen LED doch noch etwas verbessern lässt...

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Jetzt das Ganze nochmal mit einer royalblauen LED.
Da ich leider kein Datenblatt zu dieser Variante habe, hab ich sie in den Bildern mit "Eigenbau" betitelt. Leider steht mir kein Spektrometer zur Verfügung um sie vermessen.
Hier zeigt sich das sich die Suche nach einer geeigneten LED definitiv lohnt! Selbst ganz ohne Anregungsfilter sind ganz gute Aufnahmen möglich. Es scheint zumindest bei der Anregung von Chlorophyll als auch bei Acridinorange günstiger zu sein eine royalblauen LED zu verwenden. So zumindest meine Erfahrung.

[Peter_le]

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Hier zeigt sich das sich die Suche nach einer geeigneten LED definitiv lohnt! Selbst ganz ohne Anregungsfilter sind ganz gute Aufnahmen möglich. Es scheint zumindest bei der Anregung von Chlorophyll als auch bei Acridinorange günstiger zu sein eine royalblauen LED zu verwenden.
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Toll dass du was umgesetzt hast. An meiner LED muss ich noch arbeiten.

Grüße
Peter

[Spectrum]

Vielen Dank für die Blumen.
Frage:
Willst du auch eine Auflichtfluoreszenzbeleuchtung umsetzen?
Vielleicht kann ich dir da weiterhelfen?

[Spectrum]

Weiter geht's mit der Frage welche Ergebnisse man bei der Verwendung einer Weißlicht LED erwarten kann.
Belichtungszeit und ISO sind gleichgeblieben, also
1/15sec, Iso400. Weißabgleich ist auch bei allen Aufnahmen fest auf Tageslicht eingestellt. Um Abweichungen durch "Anlaufschwierigkeiten" bzw. Ausbleichen des Chlorophylls entgegenzuwirken, wurden alle Aufnahmen mit bereits länger angestrahlter Probe durchgeführt, und erfolgten in kurzen Abständen. Alles in ca 10min. Die "hellsten" Bilder dabei am Ende der Versuchsreihe.

Zuerst mit 4mm dickem Farbglasfilter BG12:
Funktioniert aber mit starkem Lichtverlust.
Jetzt mit einem alten Interferenzfilters KP490 von Zeiss Jena:
Hier ist das Bild zwar hell aber komplett rot überstrahlt. Mit blauer LED war das Bild gut! OK, diese Filter sind nicht mehr die jüngsten und bestimmt nicht mit hochwertigen modernen Filtern vergleichbar. Sehen wir mal was passiert wenn wir zwei davon hintereinanderschalten:

Jetzt sieht das schon ganz anders aus. Was auch erkennbar wird ist das es auch sichtbare Unterschiede zwischen den verschiedenen weißen LED giebt. Der Blauanteil bei höheren Farbtemperatur en der LED hat auch seinen Einfluss.
Zuguterletzt das ganze ohne jeglichen Anregungsfilter:
Das wird dann natürlich nix.

[Spectrum]

Hier eine kleine Zwischenfrage an die Admins und Mitforisten. Ich versuche mit meinen Bildern hier eine Vergleichsübersicht für alle die einen beschädigten Filterwürfel reparieren wollen oder sich selbst etwas einfaches zusammenstellen wollen.
Macht das so Sinn?
Oder bombardiere ich euch hier nur mit einer Flut an Bildern?
Kritik am Versuchsaufbau sind natürlich auch gern gesehen.

[Spectrum]

Und damit es nicht allzu dröge wird, auch einmal Bilder von Trompetentieren (Stentor coeruleus) mit Acridinorange gefärbt:
Alles mit verhältnismäßig einfachen Mitteln umgesetzt.

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Holger,

Stell doch bitte mal deine AO Routine vor. Das Ergebnis überzeugt 🙂👍

Liebe Grüße Daniel

[Spectrum]

Das "Färbeprotokoll" für diese Aufnahme ist einfach:
Eine winzige Messerspitze AO in 5ml Volvic auflösen. In diese Stammlösung tauche ich dann einen Zahnstocher ein. Damit den Tropfen auf dem Objektträger (in dem Fall eine Stentor Milchkultur), verrühren, fertig.

[Spectrum]

Das Stentor-Bild gehört auch zu einem Test für verschiedene Filterkombinationen. Die Filterkombination/Beleuchtung hat einen sehr großen Einfluß.
Dieselben Trompeter, gleiche Rahmenbedingungen, nur ein anderer Anregungsfilter...

[Spectrum]

Zum Abschluss geht es heute noch um den Einfluss des Teilerspiegels auf das Fluoreszenzbild. Wieder für die Blauanregung von Chlorophyll.
Frage: Wie gut funktioniert das Ganze wenn man anstatt eines Dichroid ("FT510"), einen einfach verspielten Umlenkspiegel ( in diesem Fall ein "H-Pl" von Zeiss) wie er für gewöhnliches Auflicht genutzt wird, verwendet.
Auch hier gleiche Rahmenbedingungen wie zuvor. Lediglich die Belichtungszeit hat sich etwas geändert (1/25sec):
Ich würde sagen, der Unterschied ist nur sehr gering. Die erreichbaren Verschlusszeiten können sich mit 1/25sec bei Iso400 auch sehen lassen. Allerdings wurden hier auch 3Watt LED's bei voller Leistung und ein sehr lichtstarkes Fluorid Objektiv (Nikon Fluor 10 mit NA 0,5) genutzt aber die Ergebnisse sind trotzdem, glaube ich, gut vergleichbar.

Mein Fazit: Auch mit einem umfunktionierten Auflichkondensors, bzw mit einem unvollständigen Filterwürfel, läßt sich eine leistungsstarke Auflichtfluoreszenzeinrichtung improvisieren. Die richtige Wahl der LED hat dabei einen großen Einfluss. Zumindest bei der Autofluoreszenz von Chlorophyll (nach meiner Erfahrung auch bei Acridinorange), ist eine royalblaue Lichtquelle mit genügend Abstand zur Grenzwellenlänge des Langpassfilters klar im Vorteil.
Weißlicht LED's sind nur bei Verwendung mit sehr guten Anregungsfiltern und gleichzeitig großen Leistungseinschränkungen geeignet.

Liebe Grüße
Holger

[Spectrum]

Anbei noch das Spektrum der weiter oben als "Eigenbau" bezeichneten LED. Ihr Maximum liegt bei ca 447nm: