Epithelzellen und Bakterien mit Ethidiumbromid

Aljoscha · November 24, 2024, 14:57:06 NACHMITTAGS

Hallo,

nachdem in der letzten Zeit Epithelzellen als Objekt zur Färbung mit Acridinorange verwendet wurden möchte ich eine Alternative zeigen. Die Färbung mit Ethidiumbromid hebt die Zellkerne und vorhandene Bakterien deutlich hervor, während das Zellplasma weitgehend unsichtbar bleibt.

Objektiv: Plan-Neofluar 63x/1.25, Grünanregung mit Zeiss-Filtersatz 14. Die Zellen wurden fixiert und dann mit Ethidiumbromid in dest. Wasser 1:1.000.000 für 15 Minuten gefärbt, danach gewaschen und in Glyzerin eingedeckt.

Ethidiumbromid wird auch durch UV angeregt. Es fluoresziert dann gelb-orange. Allerdings sind Helligkeit und Kontrast deutlich geringer als bei Grünanregung.

Viele Grüße

Alexander

K. B. · November 24, 2024, 15:17:35 NACHMITTAGS

Hallo Alexander,

super Färbung, vor allem der Kontrast ist sehr gut ausgeprägt, nur schade das Ethidiumbromid schwierig zu bekommen ist.
Hast du auch schonmal eine Kombinations-Fluoreszenzfärbung mit EtBr ausprobiert?

Viele Grüße
Kay

Aljoscha · November 24, 2024, 17:01:54 NACHMITTAGS

Hallo Kay,

Ich verwende es nur als Einzelfärbung für DNA. Für Kombinationsfärbungen gibt es besser geeignete Farbstoffe.

Viele Grüße

Alexander

Spectrum · November 24, 2024, 23:11:58 NACHMITTAGS

Hallo Alexander,
Kontrastreiche, knackscharfe Fluoreszenzaufnahmen präsentiert du uns hier. Ich würde mich auch sehr gerne einmal an Ethidiumbromid versuchen, aber zur Zeit sind fast alle meine Filter und auch die meisten LED's unterwegs zum Ausmessen. Hole ich aber bestimmt noch nach.
Bei welcherISO/Belichtungszeit wurde die Aufnahme gemacht?
Hast du mit dem Glycerin nur eingedeckt, oder auch immergiert?
Grüße Holger

Aljoscha · November 25, 2024, 06:24:34 VORMITTAG

Hallo Holger,

Mit dem Glyzerin habe ich nur das Präparat eingedeckt. Das Objektiv wurde ganz traditionell mit Öl immergiert. Man braucht halt ein fluoreszenzfreies Öl. Belichtungszeit war 1/10 Sekunde bei ISO 1600, Canon EOS R.

Viele Grüße

Alexander

Spectrum · November 25, 2024, 06:59:52 VORMITTAG

Morgen,
Ok, danke.

Daniel Scheibenstock · November 26, 2024, 18:55:56 NACHMITTAGS

Hallo Alexander,

Danke für die gute idee. Leider hat mein erster Versuch nicht ganz geklappt. Anbei ein Bsp. Ich vermute überfärbt ?

Liebe grüße Daniel

Aljoscha · November 26, 2024, 23:36:31 NACHMITTAGS

Hallo Daniel,

Ja, das sieht nach Überfärbung aus. Ich habe oben ja die Verdünnung genannt, mit der ich arbeite.

Viele Grüße

Alexander

Daniel Scheibenstock · November 27, 2024, 08:15:41 VORMITTAG

Danke für die Bestätigung,

Vlt bin ich eine kommastelle verrutscht beim Rechnen🙈 Wie hast du eigentlich fixiert?

Aljoscha · November 27, 2024, 08:38:14 VORMITTAG

Hitzefixierung, die hat den Vorteil, dass die Probe gut am Objektträger haftet und so das Waschen übersteht.

Daniel Scheibenstock · November 27, 2024, 23:32:56 NACHMITTAGS

So neuer Versuch, Hitzefixiert. Saurer Puffer 30ul, 10ul von meiner Eth.Bromid Lösung und siehe da jetzt schaut das schon sehr gut aus:

Das Foto entstand auf dem Zeiss Universal mit einem 40 Neofluar, Bild ist zugeschnitten und etwas bearbeitet.

Die Probe ist dieses Mal etwas besonderes. Als ich den Abstrich machen wollte kam gerade unser Hind zur Türe rein..........

)) :-)

Holger Adelmann · November 29, 2024, 18:25:00 NACHMITTAGS

Liebe Kollegen,

das sind schöne Bilder. Bitte dran denken, dass Ethidiumbromid aufgrund seiner sehr hohen Affinität zu Nukleinsäuren stark mutagen ist. Also bitte Vorsicht - besonders mit dem Pulver. Und bitte sachgerecht entsorgen. Das Zeug gehört nicht in den Ausguss....

Viele Grüße,
Holger

Daniel Scheibenstock · November 29, 2024, 20:09:11 NACHMITTAGS

Als Nachtrag zur Warnung: ein interessantes Dokument der Fa. Roth:

https://www.carlroth.com/medias/Infobroschuere-Gelfaerbung-Nukleinsaeuren-DE.pdf?context=bWFzdGVyfHRlY2huaWNhbERvY3VtZW50c3w1MTAwNjN8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfGRHVmphRzVwWTJGc1JHOWpkVzFsYm5SekwyaGpNQzlvTkRndk9URXlNVFUxT1RFNE16TTVNQzV3WkdZfDdmMjA0MmVkZTFlOWU0NjMxZmI1YjU0NjRkNWQ5NWIxNGM0NGZkNGQyMjBjZGMyMzM1YTI3MjJhYjcxMjYzYTM

Liebe Grüße Daniel

Aljoscha · November 29, 2024, 23:56:37 NACHMITTAGS

Hallo,

An diesem Beispiel sieht man sehr schön, wie sich Fakten im Lauf der Weiterverbreitung verändern.
Aus "Karzinogenität kann nicht völlig ausgeschlossen werden." und "potenziell erbgutverändernd" wird "ist stark mutagen".

Die wässrige Lösung ist nicht gefährlicher als die Farbstofflösungen, die jeder Mikroskopiker im Schrank hat. Das Pulver ist eine andere Sache, das muss man mit Sachverstand und größter Vorsicht handhaben. In den meisten Universitätslabors ist den Studenten der Umgang mit dem Pulver verboten.

Übrigens sagt das Sicherheitsdatenblatt für Natriumchlorid "Das Eindringen in die Kanalisation oder in Oberflächen- und Grundwasser verhindern. Verunreinigtes Waschwasser zurückhalten und entsorgen." Also nie wieder das Kochwasser für die Nudeln einfach in den Ausguss kippen. Das muss fachgerecht entsorgt werden. Von konzentrierteren Salzlösungen wie etwa Urin wollen wir lieber nicht reden.

Viele Grüße

Alexander

Daniel Scheibenstock · November 30, 2024, 01:07:32 VORMITTAG

Liebe Kolleginnen und Kollegen,

ich möchte weder etwas verharmlosen noch unnötige Panik schüren. Das von mir geteilte Papier zeigt jedoch klar auf, wie in solchen Fällen vorzugehen ist: Handschuhe sollten verwendet werden, da mögliche gesundheitliche Risiken nicht vollständig ausgeschlossen werden können. Darüber hinaus wird darauf hingewiesen, dass das Material ordnungsgemäß entsorgt werden muss. Den Hinweis auf eine verantwortungsvolle Arbeitsweise würde ich ohnehin als Standard beim Umgang mit Chemikalien voraussetzen.

Noch ein positiver Hinweis: Ethidiumbromid ist auch in vorverdünnten Tropfflaschen erhältlich. Diese bieten eine praktische Alternative, da sie durch ihre geringere Konzentration keine Gefahrenhinweise tragen und den sicheren Umgang erleichtern.